Методы идентификации белка. Физико-химические свойства белков
Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются: высокая вязкость растворов,незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению Уф-лучей при 280 нм (это последнее свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).
Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2-и СООН-групп и характеризуются соответственно всеми св-вами кислот и оснований.
Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Их растворы обладают очень низким осмотическим давлением, высокой вязкостью и незначительной способностью к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах.
С коллоидным состоянием белков связан рад характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах, микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проходить через, полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например почек, капсула почечного клубочка (Шумлянского -Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови, и они появляются в моче.
Денатурация белка под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана - уникальной структуры нативной молекулы белка, приводящее к потере характерных для нее свойств (рас-творимости, злектрофоретической подвижности, биологической активности и т. д.). Большинство белков денатурируют при нагревании их раствором выше 50-60о С. Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-rpyпп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической антигенной или гормональной) При денатурации разрушаются в основном нековалентные (в частности, водородные) связи и дисульфидные мостики и не затрагиваются пептидные связи самого остова полипептидной цепи При этом развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.
Рассматриваемые вопросы:Методы выделения органелл и мембран из тканей, клетки.
Этапы субклеточного фракционирования: экстракция,
гомогенизация и центрифугирование, их особенности.
Методы разделения и очистки субклеточных компонентов.
Выделение мембранных частиц.
Идентификация мембранных фракций, критерии их очистки.
Контроль наличия примесей с помощью световой и
электронной микроскопии, анализа липидного состава или
определении активности маркерных ферментов.
Определение белкового состава в выделяемых мембранных
фракциях. Определение активности маркерных ферментов
определенного типа выделенной мембранной фракции. Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать
их биохимию и функциональные особенности. Например, можно создать
бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезировать белок
по заданной экспериментатором информационной РНК. Выделенные
митохондрии в подобранных условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на
выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может
происходить синтез РНК и т.д.
В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания
клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от
гранул желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских
ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту
бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага).
Такая ДНК связывается с белками-гастонами, которые есть в избытке в
таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид),
который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже
ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие,
интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в
ядро, и наоборот. В цитоплазматических экстрактах яиц земноводных и
иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти
модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции
клеточного цикла.Для того чтобы выделить клеточные органеллы,
исследуемый образец измельчают и
затем гомогенизируют в забуференной среде с
использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема
(тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном
цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который
особенно предпочтителен для выделения лабильных
молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения
клеток включают ферментативный лизис, разрушающий
клеточные стенки, или механическое разрушение
замороженных тканей (размолом или с помощью
вращающихся ножей; под большим давлением;
осмотическим шоком; многократным чередованием
замораживания и оттаивания). Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой
проводится гомогенизация, была изотонической, т.е.
осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению
внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут
«впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в
гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.
Вслед за гомогенизацией следует фильтрование для удаления
интактных клеток и соединительных тканей. Собственно
фракционирование клеточных органелл проводится с помощью
дифференциального центрифугирования, т.е. центрифугирования
при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое
увеличение центробежной силы (которую принято выражать
величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g
= 9,81 м/с2) приводит к последовательному осаждению различных
органелл, т.е. их разделению в соответствии с плотностью и
размером.Одним из основных способов выделения клеточных структyp является
дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его
применения в том, что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их
размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее
она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседания варьируют
ускорения, создаваемые центрифугой.
При центрифугировании раньше всего и при небольших ускорениях осядут ядра
и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы,
макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид, пероксисом,
лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной
системы клетки.
При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфрак-ций
можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной
подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При
разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи,
фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В
случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в
градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты,
даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе. Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких
температурах (0-5°С) для того, чтобы уменьшить степень
деградации материала за счет реакций, катализируемых
ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения
ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для
защиты функциональных SH-групп от окисления.
Прежде чем выделенные фракции анализировать биохимическими
способами, необходимо проверить их на чистоту с помощью
электронного микроскопа.
Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность
изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно
создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут
синтезировать белок по заданной экспериментатором
информационной РНК. Выделенные митохондрии в подобранных
условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине
при участии соответствующих ферментов может происходить
синтез РНК и т.д.Основы метода центрифугирования
Частицы в растворе осаждаются (седиментация),
когда их плотность выше плотности раствора, или
всплывают (флотация), когда их плотность ниже
плотности раствора. Чем больше разница в
плотности, тем быстрее идет распределение частиц.
Когда плотности частиц и раствора одинаковые
(изопикнические условия), частицы остаются
неподвижными. При малой разнице в плотности
частицы можно разделить только в центрифуге,
которая создает центробежную силу, во много раз
превышающую силу земного притяжения.соотношение между плотностью и коэффициентом седиментациидля
различных частиц в растворе хлорида цезия (CsCI). Скорость седиментации частицы (ν) зависит от угловой
скорости (ω), эффективного радиуса ротора rэфф(расстояние от
оси вращения) и седиментационных свойств частиц.
Седиментационные свойства частицы
характеризуются коэффициентом седиментации S и
выражаются в единицах Сведберга (1S = 10-13с).
Величина S может колебаться в широких пределах. Для
сравнения коэффициентов седиментации в различных средах
их обычно корректируют по плотности и вязкости водыпри
20oC (S20w).
Коэффициент седиментации зависит от молекулярной массы
(М) частицы, ее формы (коэффициент трения f),
парциального удельного объема ΰ (величина, обратная
плотности частицы).
Центрифугирование в градиенте плотности
Макромолекулы или органеллы, незначительно различающиеся по размеру или по плотности,
можно разделитьцентрифугированием в градиенте плотности. Для этих целей используются два
метода.
При зональном центрифугировании анализируемая проба (например, белки или клетки)
наслаивается тонким слоем поверх буферного раствора. В процессе центрифугирования частицы
проходят через раствор, так как их плотность выше плотности раствора. Скорость движения
зависит от массы и формы частиц (см. формулы на схемеА). Центрифугирование прекращают
прежде, чем частицы достигнут дна центрифужной пробирки. Затем дно прокалывают и
собирают ряд фракций, содержащих различные частицы. Стабильность градиента плотности в
процессе центрифугирования достигается применением растворов углеводов или коллоидного
силикагеля,концентрация которых возрастает от поверхности к дну пробирки. Градиент плотности
препятствует образованию конвекционных потоков, снижающих качество разделения.
При изопикническом центрифугировании пробу (например ДНК, РНК или вирусы) равномерно
распределяют во всем объеме раствора (обычно CsCI). В этом случае разделение продолжается
значительно дольше, чем при зональном центрифугировании. Градиент плотности создается в
процессе центрифугирования за счет седиментациии диффузии. Со временем каждая частица
попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование
прекращают, когда устанавливается равновесие. Полученные фракции анализируют, используя
подходящую измерительную технику.Молекулы-маркеры
В процессе фракционирования важно
контролировать чистоту фракций. Присутствие
в определенной фракции той или иной
органеллы и наличие других компонентов
определяют с помощью молекул-маркеров.
Обычно это органеллоспецифичные
ферменты (ферменты-маркеры).
Распределение ферментов-маркеров в клетке
отражает локализацию в ней
соответствующих каталитических реакций.Функции и состав биомембран
Наиболее важными мембранами в животных клетках
являются плазматическая мембрана, внутренняя и
внешняя ядерные мембраны, мембраны
эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи
, внутренние и внешние митохондриальные
мембраны. Лизосомы, пероксисомы, различные
везикулы также отделены от цитоплазмымембранами
. Клетки растений содержат дополнительно мембраны
хлоропластов, лейкопластов и вакуолей. Все
мембраны полярны, т.е. существует различие в
составах внутреннего и внешнего по отношению к
цитоплазме слоев.Биомембраны и их составляющие выполняют следующие функции:
1. Ограничение и обособление клеток и органелл. Обособление клеток от межклеточной
среды обеспечиваетсяплазматической мембраной, защищающей клетки от
механического и химического воздействий. Плазматическая мембрана обеспечивает
также сохранение разности концентраций метаболитов и неорганических ионов между
внутриклеточной и внешней средой.
2. Контролируемый транспорт метаболитов и ионов определяет внутреннюю среду, что
существенно для гомеостаза, т.е. поддержания постоянной концентрации метаболитов и
неорганических ионов, и других физиологических параметров. Регулируемый и
избирательный транспорт метаболитов и неорганических ионов через поры и
посредством переносчиков становится возможным благодаря обособлению клеток и
органелл с помощью мембранных систем.
3. Восприятие внеклеточных сигналов и их передача внутрь клетки, а также инициация
сигналов.
4. Ферментативный катализ. В мембранах на границе между липидной и водной фазами
локализованы ферменты. Именно здесь происходят реакции с неполярными
субстратами. Примерами служат биосинтез липидов и метаболизмнеполярных
ксенобиотиков. В мембранах локализованы наиболее важные реакции энергетического
обмена, такие, как окислительное фосфорилирование (дыхательная цепь) и фотосинтез.
5. Контактное взаимодействие с межклеточным матриксом и взаимодействие с другими
клетками при слиянии клетоки образовании тканей.
6. Заякоривание цитоскелета, обеспечивающее поддержание формы клеток и органелл
и клеточной подвижности.После гомогенизации образца, центрифугирования гомогената с
разной скоростью получают отдельные фракции, содержащие
клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также
надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые
белки цитозоля клетки.
Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение
олигомерных белков на протомеры
Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами
клетки, его необходимо перевести в раствор.
Для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками
и липидами мембран в раствор добавляют детергенты: Чаще
всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.
При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные
взаимодействия между протомерами в олигомерных белкахУдаление из pacтвopa небелковых веществ
Нуклеиновые кислоты, липиды и Другие
небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физикохимические
свойства. Так, липиды легко
удаляются
из
раствора
добавлением
органических
растворителей,
например
ацетона. Однако воздействие должНо бытЬ
кратковременным. так как ацетон вызывает
денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые
кислоты осаждают добавлением в раствор
стрептомицина.Выделение липидов мембран осуществляют сразу после получения мембранной
фракции, которую необходимо защищать от действия протео- и липолитических
ферментов, автоокисления.
Обычно все процедуры проводят при низкой температуре, поддерживая определенные
значения pH и ионной силы. Для экстракции липидов используют смесь хлороформ-
метанол. Для одновременной экстракции белков и липидов из теней эритроцитов их
экстрагируют смесью бутанол-вода. При этом большая часть белков переходит в
водный, а липида в бутанольный слой.
Количественный анализ сложных смесей фосфолипидов проводят
хроматографическими методами. Для препаративных целей в основном используют
хроматографию на колонках. Для микроаналитических исследований успешно
применяют тонкослойную хроматографию, с помощью которой можно разделить
практически все классы липидов, локализовать и идентифицировать их при
использовании специальных реактивов.
По элюирующей способности растворители располагаются в следующем
возрастающем порядке петролейный эфир, цикло-гексан, четыреххлористый углерод,
толуол, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, н-пропанол,
этанол, метанол, вода. После пропускания растворителей пластинку высушивают на
воздухе и идентифицируют липиды с помощью окрашивания специфическими
реагентами. Для количественного определения фосфолипидов, разделенных
тонкослойной хроматографией, используют спектрофотометрические методы. Исследования мембран в значительной
мере базируются на двух основных
методических приемах: это разборка
нативной (то есть природной) мембраны на
составляющие ее элементы и последующая
полная или частичная сборка искусственной
мембраны с использованием всех или
части компонентов исходной мембраны.
Применительно к мембранам эти приемы
получили название "солюбилизация" и
"реконструкция». Для солюбилизации лучше использовать детергенты с
низкой ККМ, так как такие детергенты легче
встраиваются в мембрану и быстрее вызывают ее
распад до смешанных мицелл. В этом качестве
наиболее эффективны ионные детергенты.
В качестве параметров, характеризующих способность
детергентов к мицеллообразованию, обычно
используют критическую концентрацию
мицеллообразования (ККМ) и число агрегации. ККМ –
это та концентрация, при которой детергент начинает
образовывать мицеллы. До этого он находится в воде
в мономерной форме в состоянии истинного
раствора. Число агрегации показывает, сколько
молекул детергента приходится на одну мицеллу.Чаще всего используются четыре основных способа удаления
детергента: диализ, гель-фильтрация, сильное разбавление
солюбилизата и адсорбция детергента на гидрофобных полимерах.
Более быстрый способ основан на удалении детергента с помощью
гель-фильтрации, когда солюбилизат пропускают через инертный
гель, размер пор которого достаточно велик, чтобы удержать
молекулы детергента, но мал по сравнению с образующимися
мембранными частицами, которые свободно проходят между
гранулами геля.
С максимальной полнотой детергент может быть удален из мембраны
путем его адсорбции на гидрофобных полимерах. Этот способ
особенно хорош для удаления остаточных количеств детергента из
уже сформировавшихся мембранных частиц. Однако для удаления
детергента из исходного солюбилизата он малопригоден, так как на
начальных стадиях реконструкции удаление детергента может
сопровождаться адсорбцией значительных количеств белка и липида
на полимере. Поэтому обычно этот метод используют в комбинации с
другими способами на конечной стадии удаления детергента.
высаливание : осаждение солями щелочных, щелочноземельных металлов (хлорид натрия, сульфат магния), сульфатом аммония; при этом не нарушается первичная структура белка;
осаждение : использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах (около –20 С).
При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.
Денатурация - нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).
Методы разделения белков Отделение белков от низкомолекулярных примесей
Диализ
Используют специальную полимерную мембрану, которая имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.
Разделение белков по молекулярной массе
Гель-хроматография
Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.
Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации
Ультрацентрифугирование
Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия) (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Разделение белков методом ультрацентрифугирования
Электрофорез
Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.
Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют бóльшие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, бóльшие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие (рис. 2.3).
Рис. 2.3 . Разделение белков методом электрофореза в геле
Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na) .
Выделение
индивидуальных белков
Аффинная
хроматография
Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.
Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку, и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.
Изоэлектрофокусирование
Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, у которого заранее сформирован градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).
Двухмерный электрофорез
Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.
Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)
Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце (рис 2.4).
Выделение белков из биологического материала.
Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.
Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших работ.
Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения оставшихся пор.
Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся разделенные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают антитела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным антителам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молекулярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки используются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: стандартизация метода и улучшение результатов.
Обработка раствором первичных антител связывание происходит в том месте пластины, где есть антиген (искомый белок).
Удаление несвязавшихся антител (промывка).
Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки.
Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка).
Рис. 2.4 . Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)
В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке появляется полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антителами.
Для идентификации белков используются различные системы поиска в базах данных EMBL, Sequest, разработанные внутри исследовательских коллективов. Однако стандартом для идентификации белков стала поисковая машина Mascot. Как практически во всех поисковых системах в ней используется вэб-интнерфейс и сама поисковая система доступна в Интернете, но ее также можно приобрести и установить на компьютере пользователя.
Mascot может работать с различными подключаемыми белковыми и геномными базами данных. Это могут быть обширные общедоступные базы, такие как NCBI или SwissProt, коммерческие, а также созданные самим пользователем.
Во всех системах идентификация осуществляется по полученным исследователем масс-спектрометрическим данным, путем их сопоставления с известными структурами белков.
Учитывая, что в последние десятилетия сиквенирование белков свелось, по сути, с сиквенированию кодирующих их генов, на практике разумнее идентифицировать белки сопоставляя экспериментальные масс-спектрометрические данные с известными геномами.
Существуют различные алгоритмы идентификации белков, однако их возможности ограничены известными на сегодняшний день геномами. Хотя, учитывая что организмы разных видов все-таки имют гомологичные белки, зачастую удается идентифицировать белки из организмов с неизвестным геномом.
Различные методические подходы протеомных исследований, дают принципиально различные типы данных, и требуют своих вычислительных подходов при обработке.
Наиболее доступным и высокопроизводительном является метод идентификации по масс-спетрометрическим пептидным картам специфического протеолитического гидролиза. В англоязычной литературе он известен как Peptide Mass Fingerprint (PMF) В качестве специфической протеазы чаще всего используется трипсин. На первом этапе выделенный (например, элетрофорезом) белок подвергается протеолитическому гидролизу. В результате такого гидролиза получается смесь пептидов. Учитывая, что используется высокоспецифичная протеаза, это будет смесь вполне определенных пептидов. Так, при использовании трипсина белок будет "порезан" по аргинину и лизину.
Следующий этап - регистрация масс-спектра полученной смеси. В результате чего получается набор или список молекулярных масс. Он не дает никакой информации о структуре или других свойствах продуктов, в основе метода только предположение что это молекулярные массы пептидов, и эти пептиды образовались в результате специфического гидролиза. Здесь и спрятана главная идея подхода - если каждый белок имеет свой набор пептидов и соответствующий ему перечень молекулярных масс, то вполне возможно и решение обратной задачи - найти для полученного перечня молекулярных масс соответствующий ему белок. И такую задачу действительно часто удается решить.
В частности это позволяет сделать маскот.
ГОСТ Р 53761-2009
Группа Н19
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО
Идентификация белкового состава электрофоретическим методом в полиакриламидном геле
Milk. Identification of protein composition by use of electrophoresis in polyacrilamide gel
ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209
Дата введения 2011-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании" , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Ярославской области "Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов" (ГУ ЯО "ЯГИКСПП")
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 "Молоко и продукты переработки молока"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 декабря 2009 г. N 1271-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает метод идентификации в его составе белков молочного и немолочного происхождения с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ Р 52054-2003 Молоко коровье сырое. Технические условия
ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения
ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия
ГОСТ 5860-75 Реактивы. Кислота аминоуксусная. Технические условия
ГОСТ 5867-96 Молоко и молочные продукты. Методы определения жира
ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 7730-89 Пленка целлюлозная. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 20478-75 Реактивы. Аммоний надсернокислый. Технические условия
ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия
ГОСТ 24104-2001 * Весы лабораторные. Общие технические требования
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия.
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативными правовыми актами Российской Федерации , ГОСТ Р 52349 , ГОСТ Р 52738 .
4 Сущность метода
Электрофорез - метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных молекул под действием внешнего электрического поля.
Находящиеся в буферном растворе (ПААГ геле) макромолекулы белков обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. При пропускании электрического тока вдоль геля, устанавливается определенный градиент напряжения, т.е. формируется электрическое поле. Под действием этого поля макромолекулы белков в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. Исследуемая проба, состоящая из различных молекул, разделяется на зоны молекул с одинаковой молекулярной массой и зарядом, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине геля в виде полос и закрепляются.
5 Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы
Ячейка для вертикального электрофореза со следующими параметрами:
- общие размеры ячейки 260х190х300 мм;
- центральный термостатируемый резервуар и адаптер для трубок, изготовленные из формованного полимера;
- нижняя электродная камера и крышка, изготовленные из формованного поликарбоната;
- зажимы, подставка для заливки и эксцентрики, изготовленные из остеклованного и армированного тефлоном поликарбоната;
- электроды, изготовленные из платиновой проволоки диаметром 0,254 мм;
- пластины стеклянные размером: внутренний - 200х200 мм и внешний - 200х225 мм;
- предельное значение напряжения 1000 В.
Источник напряжения с диапазоном регулируемого напряжения (20-5000) В, силой тока (0,01-500) мА и мощностью (0,1-400) Вт.
Компьютер с характеристиками не ниже: /Celeron 600/250 mb/HDD 4Gb/CD-ROM/ видеокарта 4 Mb.
Монитор цветной с минимальными требованиями: разрешение экрана 1024x768, качество цветопередачи 16-бит.
Фотоаппарат цифровой с минимальными требованиями: разрешающая способность 1024x768, матрица - 1,3 млн. пикселей.
Анализатор потенциометрический с диапазоном измерения (0-12) ед. рН, с ценой деления 0,1 ед. рН.
Весы лабораторные 1-го класса точности (специальные) по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0003 г.
Термометр лабораторный шкальный от 0 °С до 100 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498 .
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс" (скорость вращения 250-3000 об/мин).
Термостат твердотельный типа "Гном" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см с диапазоном рабочих температур от окружающей до 99 °С.
Холодильник бытовой электрический любого типа, обеспечивающий поддержание температуры в холодильной камере (4±2) °С по ГОСТ 16317 .
Плитка электрическая бытовая с регулируемым обогревом любого типа по ГОСТ 14919 .
Электросепаратор бытовой, обеспечивающий получение обезжиренного молока с массовой долей жира не более 0,05%.
Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752 .
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .
Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.
Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" (частота вращения не менее 13000 об/мин).
Мешалка магнитная с регулируемым электрообогревом любого типа.
Баня водяная, обеспечивающая нагрев до температуры 50 °С.
Пипетдозаторы одноканальные переменного объема:
- рабочий объем 0,002-0,02 см, шаг переменного объема 0,001 см;
- рабочий объем 0,02-0,2 см, шаг переменного объема 0,01 см;
- рабочий объем 0,2-1 см, шаг переменного объема 0,1 см.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .
Пленка целлюлозная по ГОСТ 7730 .
Воронка В-75-80 ХС по ГОСТ 25336 .
Колбы исполнения 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 .
Колбы исполнения 1-100, Кн-1-50-14/23 ХС, Кн-1-100-29/32 ХС, Кн-1-250-24/29 ХС, Кн-1-500-29/32 ХС, Кн-1-2000-29/32 ХС по ГОСТ 25336 .
Цилиндры исполнения 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 .
Эксикатор по ГОСТ 23932 .
Пипетка исполнения 1-1-2-10, 1-1-2-25 по ГОСТ 29227 .
Насос водоструйный по ГОСТ 25336 .
Микрошприц вместимостью 0,05 см.
Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см.
Стакан исполнения В-1-50 ХС, В-1-100 ХС, В-1-250 ХС по ГОСТ 25336 .
Наконечники для дозаторов с переменным объемом 0,02, 0,2 и 1 см.
Акриламид (массовая доля основного вещества не менее 99,9%).
N",N"-Метиленбисакриламид, для электрофореза.
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (массовая доля основного вещества не менее 99,8%).
Карбамид, ч.д.а., по ГОСТ 6691 .
Кумасси бриллиантовый голубой G-250, для электрофореза.
Кислота аминоуксусная, х.ч., по ГОСТ 5860 .
Бромфеноловый синий, для электрофореза.
Аммоний надсернокислый, х.ч., по ГОСТ 20478 .
N,N,N",N"-Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), для электрофореза.
Ацетон, х.ч., по ГОСТ 2603 .
Глицерин, ч.д.а., по ГОСТ 6259 .
Эфир диэтиловый, ч.д.а., по .
Кислота соляная, х.ч., по ГОСТ 3118 .
Аммоний сернокислый, х.ч., по ГОСТ 3769 .
Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 .
Кислота уксусная ледяная, х.ч., по ГОСТ 61 .
Кальций хлористый безводный по ГОСТ 450 .
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .
Допускается применять другие средства измерений, вспомогательные устройства и реактивы с метрологическими или техническими характеристиками не хуже указанных.
6 Отбор проб для анализа
Основные понятия и общие правила отбора проб - по ГОСТ 13928 и ГОСТ 26809 .
Пробы транспортируют при температуре от 2 °С до 8 °С не более 12 ч.
В случае, если анализ не может быть проведен сразу, пробы рекомендуется хранить в холодильнике при температуре (4±2) °С не более 24 ч.
Не допускается консервирование проб.
7 Подготовка к проведению анализа
7.1 Приготовление растворов
7.1.1 Раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм
В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят около 500 см дистиллированной воды и 90 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,174 г/см (или 85 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,188 г/см), аккуратно перемешивают и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора - 3 мес.
7.1.2 Раствор карбамида молярной концентрацией 6 моль/дм
В химическом стакане вместимостью 50 см растворяют (18,02±0,01) г карбамида в 30 см дистиллированной воды, переливают в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.
7.1.3 Раствор лидирующего красителя
В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г бромфенолового синего, добавляют 1 см дистиллированной воды и перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" (до полного растворения красителя).
Срок хранения раствора при температуре (4±2) °С - 1 мес.
7.1.4 Раствор трис-НСl
В химическом стакане вместимостью 100 см растворяют (6,070±0,001) г трис-(гидрооксиметил) аминометана в 50 см дистиллированной воды, доводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм до (8,8±0,1) ед. рН, переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки.
7.1.5 Раствор мономеров полиакриламидного геля
В коническую колбу вместимостью 50 см вносят (3,1040±0,0003) г акриламида, (0,0960±0,0003) г N",N"-метиленбисакриламида, (3,1040±0,0003) г карбамида, добавляют 8,75 см раствора трис-НСl, приготовленного по 7.1.4 и 26 см дистиллированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке с электроподогревом при температуре (50±5) °С в течение 30 мин и охлаждают до комнатной температуры.
Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.
Примечание - Количество раствора для полиакриламидного геля дано для одного анализа и получения геля размером (160х160х1) мм.
7.1.6 Раствор электродного буфера
В мерную колбу вместимостью 500 см вносят (4,50±0,01) г трис-(гидрооксиметил) аминометана, (21,60±0,01) г аминоуксусной кислоты и растворяют в 300 см дистиллированной воды, полученный объем доводят до метки, переливают в коническую колбу вместимостью 2000 см и добавляют 1000 см дистиллированной воды.
Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.
Примечание - Количество электродного буфера одного анализа дано для одной электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в разделе 5. При использовании электрофоретической ячейки другого типа количество электродного буфера должно быть соответственно скорректировано.
7.1.7 Раствор для окрашивания геля
В коническую колбу вместимостью 500 см вносят (0,50±0,01) г кумасси бриллиантового голубого, добавляют 200 см этилового спирта, 50 см кислоты уксусной ледяной и 250 см дистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.
7.2 Подготовка контрольных проб
Для приготовления контрольных проб используют сырое молоко по ГОСТ Р 52054 и с кислотностью (16,0-20,0) °Т без содержания консервантов и ингибирующих веществ.
7.2.1 Отделение жира
7.2.1.1 Метод сепарирования
(0,4-0,5) дм молока перед сепарированием подогревают на водяной бане до температуры (40-45) °С.
Через 1-2 мин после включения электропривода сепаратора для прогрева молочного тракта через электросепаратор пропускают 1 дм дистиллированной воды, нагретой до температуры (40-50) °С. Далее, не выключая электропривод сепаратора, заливают предварительно подогретое молоко и сепарируют. После сепарирования обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.
7.2.1.2 Метод центрифугирования
(0,4-0,5) дм молока помещают в центрифужные пробирки или стаканы и центрифугируют при 5000 об/мин в течение (20-30) мин. После центрифугирования центрифужные пробирки (стаканы) помещают в холодильник и охлаждают при температуре (4±2) °С. После полного охлаждения застывший верхний жировой слой удаляют, а оставшееся обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.
7.2.2 Выделение белков
В химический стакан вместимостью 250 см вносят 50 см предварительно обезжиренного молока (с массовой долей жира не более 0,05% по ГОСТ 5867-90), нагревают на водяной бане до температуры (35-40) °С и осаждают казеин, прибавляя по каплям раствор соляной кислоты, приготовленный по 7.1.1. Осадку дают отстояться, сыворотку осторожно сливают. Осадок промывают, добавляя 50 см дистиллированной воды, перемешивают, дают отстояться и сливают воду. Промывку проводят не менее пяти раз.
К отмытому осадку добавляют 30 см ацетона и оставляют на 30 мин, затем ацетон осторожно сливают. Действие повторяют до полного удаления жира, но не менее пяти раз. Осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, заливают 120 см диэтилового эфира и закрывают притертой пробкой. Перемешивают не менее 5 мин и оставляют на 12 ч в холодильнике. Через 12 ч осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и подсушивают на воздухе в вытяжном шкафу не менее 1 часа.
(10,0±0,1) г подсушенной пробы переносят в коническую колбу вместимостью 100 см, добавляют 60 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, перемешивают на магнитной мешалке при температуре (50±5) °С до полного растворения белка. Получившийся раствор переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ (освобождение раствора от низкомолекулярных соединений) проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. После чего образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 часов.
Срок хранения выделенного казеина при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.
Сыворотку, оставшуюся после выделения казеина, сливают в коническую колбу вместимостью 250 см и добавляют аммоний сернокислый (на 25 см сыворотки (17,5±0,1) г аммония сернокислого), и тщательно перемешивают до полного растворения. Помещают в холодильник при температуре (4±2) °С на 12 ч. Отделившийся белок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. Через 24 ч образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 ч.
Срок хранения сывороточных белков при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.
7.3 Подготовка исследуемых проб молока
Отделение жира и выделение белков исследуемых проб молока осуществляется по 7.2.1 и 7.2.2.
7.4 Приготовление растворов белков
7.4.1 Приготовление контрольных растворов белков
В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г белка, выделенного по 7.2, 7.3, добавляют 0,5 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, выдерживают в термостате при температуре 95 °С в течение 5 мин, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до полного растворения белков. К полученному раствору добавляют 0,2 см глицерина и 0,025 см лидирующего красителя, приготовленного по 7.1.3, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугируют при частоте 3000 об/мин в течение 5 мин, образовавшийся осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют для анализа.
Срок хранения растворов белков при температуре (4±2) °С - не более семи суток.
7.4.2 Приготовление исследуемых растворов белков
Приготовление исследуемых растворов белков осуществляется по 7.4.1.
8 Условия проведения анализа
При выполнении анализа должны соблюдаться следующие условия:
Температура окружающего воздуха | ||||
Относительная влажность воздуха | от 30% до 80% | |||
Атмосферное давление | от 84 до 106 кПа | |||
Напряжение в сети | ||||
Частота переменного тока | ||||
9 Проведение анализа
При сборке камеры для полимеризации геля используют стеклянные пластины размером: внутренняя - (200х200) мм и внешняя - (200х225) мм.
На внешнюю пластину справа и слева вдоль длинных сторон помещают спейсеры (пластинки) толщиной 1 мм. Поверх спейсеров накладывают внутреннюю стеклянную пластину. Пластины фиксируют зажимами справа и слева и устанавливают на подставку для заливки с желобом для выравнивания. Камеру проверяют на герметичность с помощью дистиллированной воды, которую затем удаляют. После проверки камеры на герметичность между пластинами камеры под небольшим углом помещают гребенку для формирования лунок.
Для обеспечения нормального процесса полимеризации геля раствор мономеров, приготовленный по 7.1.5, подвергают деаэрации в колбе с тубусом, присоединенной к водоструйному насосу. После деаэрации в раствор добавляют (0,0180±0,0003) г аммония надсернокислого и 0,018 см N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина, осторожно перемешивают для предотвращения образования пузырей в растворе. Стеклянной пипеткой с грушей вдоль края спейсера (с приподнятой стороны гребенки) раствор вносят в камеру для полимеризации.
Гель полимеризуется в течение 45 мин, после чего гребенку извлекают и ополаскивают образовавшиеся в геле лунки дистиллированной водой.
Камеру с гелем прикрепляют к термостатируемой части и помещают в электрофоретическую ячейку.
В электродные камеры ячейки заливают электродный буфер, приготовленный по 7.1.6.
В лунки геля под электродный буфер с помощью микрошприца вносят контрольные и исследуемые растворы белков, приготовленные по 7.4. Крайние лунки геля рекомендуется использовать для контрольных растворов белков. Количество раствора, вносимого в одну лунку, составляет (0,020-0,025) см. После каждого внесения микрошприц тщательно промывают раствором электродного буфера.
Для получения достоверных результатов рекомендуется каждый исследуемый раствор белка вносить не менее чем в трех повторностях.
После внесения контрольных и исследуемых растворов электрофоретическую ячейку закрывают крышкой.
Электрофорез проводят в течении (4-5) ч в режиме постоянного напряжения (120-130) В.
Примечание - Режим указан для электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в 5, и полиакриламидного геля размером (160х160х1) мм. При использовании ячейки другого типа или геля с другими размерами режим проведения электрофореза подбирается индивидуально.
Для предотвращения неравномерного распределения тепла и искажения белковых зон (полос) рекомендуется обеспечить принудительное охлаждение термостатируемого резервуара.
Электрофорез считают законченным, когда лидирующий краситель опустится до нижнего края геля.
После проведения электрофореза гель аккуратно извлекают из электрофоретической ячейки, фиксируют и окрашивают. Фиксация и окраска осуществляются одновременно в растворе, приготовленном в соответствии с 7.1.7, в течение 2 ч. Для ускорения процесса допускается проводить окрашивание и фиксацию геля в течение одного часа на электроплитке при (40±5) °С, а ванночку с раствором и гелем необходимо регулярно покачивать.
Отмывку окрашенного геля производят кипячением в 10%-ном растворе уксусной кислоты до полного удаления фона с постоянной сменой отмывающего раствора по мере вымывания краски.
В приложении А приведены возможные причины отклонения от стандартного хода анализа и предложены способы их устранения.
Визуализацию разделения белков после электрофореза осуществляют с помощью фотоаппарата. Полученные электрофореграммы сохраняют на жестком магнитном носителе компьютера.
10 Интерпретация результатов анализа
Идентификацию белков молочного и немолочного происхождения осуществляют визуально.
Совпадение белковых фракций (полос) на электрофореграмме контрольного и исследуемых растворов (не менее чем в трех повторностях) указывает на отсутствие в составе продукта белков немолочного происхождения (рисунок 1).
Рисунок 1 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой отсутствуют белки немолочного происхождения
При наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения на электрофореграмме присутствуют дополнительные белковые фракции (полосы), которые не наблюдаются в контрольных пробах (рисунок 2).
Рисунок 2 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой присутствует белок немолочного происхождения
В случае возникновения сомнений о наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения (слабое изображение отдельных фракций) рекомендуется увеличить концентрацию белков в пробе и повторить анализ.
11 Требования, обеспечивающие безопасность
При проведении электрофоретического анализа необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 , требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации и инструкции по эксплуатации ячейки для электрофореза.
Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 . Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005 .
При работе с нейротоксинами следует соблюдать особую осторожность, все манипуляции обязательно проводить в резиновых перчатках и только в вытяжном шкафу.
К выполнению анализа и обработке результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное биохимическое образование, или опыт работы в биохимической лаборатории, прошедшего соответствующий инструктаж и освоившего метод в процессе обучения.
Приложение А (справочное). Причины отклонения от стандартного хода анализа и способы их устранения
Приложение А
(справочное)
Таблица А.1
Отклонение | Возможные причины | Способы устранения |
1 Полосы по краям геля расположены выше, чем в центре | Центральная часть геля нагревается сильнее краев | Центральный резервуар заполнить охлаждающим раствором |
Избыточное напряжение | Охлаждающий раствор прокачивать при температуре (10-15) °С; уменьшить напряжение |
|
2 Диффузия лидирующего красителя | Распад раствора белков пробы и/или растворов буферов | Приготовить растворы из свежих реактивов |
Диффузия | Если полосы белка имеют такой же диффузный характер, как и полоса лидирующего красителя, увеличить: силу тока на (25-50)% |
|
3 Вертикальная исчерченность трека | Избыточная концентрация белков в пробе | Уменьшить концентрацию белков в пробе; уменьшить напряжение на 25% |
4 Горизонтальная исчерченность трека | Неполное растворение белков | Полностью растворить пробу; центрифугировать |
5 Широкие или размытые полосы или пятна белков | Диффузия в связи с медленной миграцией | Увеличить силу тока на 20% |
Химические модификации ионными загрязнениями | Деионизовать раствор карбомида |
|
Неполное обезжиривание пробы | Полностью удалить жир |
|
6 Размывание полос в латеральном направлении | Диффузия растворов белков за пределы лунок до включения напряжения | Уменьшить время между внесением пробы и подачей напряжения |
7 Искривленные полосы | Недостаточная полимеризация геля вокруг лунок | Дегазировать раствор мономеров геля; увеличить концентрации аммония надсернокислого и N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина на 25% |
Наличие солей в пробе | Удалить соли диализом |
|
Неровная поверхность геля | Проверить стадию взятия проб для приготовления геля, при необходимости заменить реактивы |
|
8 Электрофорез занимает более 5 ч | Высокая концентрация электродного буфера | Проверить стадию приготовления электродного буфера (при необходимости разбавить буфер), проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы |
Низкое напряжение | Увеличить напряжение на (25-50)% |
|
9 Электрофорез идет слишком быстро с плохим разрешением | Буфер слишком разбавлен | Проверить стадию приготовления электродного буфера, проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы |
Слишком высокое напряжение | Уменьшить напряжение на (25-50)% |
|
10 Наблюдается несовпадение полос в контрольных пробах | Часть белка могла окислиться во время электрофореза или не была полностью восстановлена на стадии подготовки пробы | Приготовить свежие контрольные пробы; заменить реактивы |
Библиография
Федеральный закон Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию"
ТУ 2600-001-43852015-05 Эфир диэтиловый
Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2010
