집 기름 단백질 식별 방법. 단백질의 물리화학적 성질

단백질 식별 방법. 단백질의 물리화학적 성질

단백질의 가장 특징적인 물리화학적 특성은 용액의 높은 점도, 미미한 확산, 큰 한계 내에서 팽윤하는 능력, 광학 활성, 전기장에서의 이동성, 낮은 삼투압 및 높은 종양압, 280nm에서 UV 광선을 흡수하는 능력( 후자의 특성은 단백질에 방향족 아미노산이 존재하기 때문에 단백질의 정량적 측정에 사용됩니다.

아미노산과 마찬가지로 단백질은 자유로운 NH2 및 COOH 그룹이 존재하기 때문에 양쪽성이며 그에 따라 산과 염기의 모든 특성을 특징으로 합니다.

단백질은 뚜렷한 친수성을 가지고 있습니다. 이들 솔루션은 삼투압이 매우 낮고 점도가 높으며 확산 능력이 낮습니다. 단백질은 매우 큰 범위 내에서 팽창할 수 있습니다.

다수의 특징적인 특성은 단백질의 콜로이드 상태, 특히 비탁법에 의한 단백질의 정량적 측정의 기초가 되는 광산란 현상과 관련되어 있습니다. 이 효과는 생물학적 물체를 현미경으로 관찰하는 현대적인 방법에도 사용됩니다. 단백질 분자는 신장, 신장 사구체 캡슐(Shumlyansky- Bowman)은 혈청 알부민을 투과하게 되어 소변에 나타납니다.

다양한 물리적 및 화학적 요인의 영향으로 인한 단백질 변성은 단백질을 응고 및 침전시켜 원래의 특성을 잃게 만듭니다. 따라서 변성은 기본 단백질 분자의 독특한 구조인 일반적인 계획을 위반하여 그 특징적인 특성(용해도, 전기영동 이동성, 생물학적 활성 등)의 손실로 이어지는 것으로 이해되어야 합니다. 대부분의 단백질은 50-60oC 이상의 용액으로 가열하면 변성됩니다. 변성의 외부 발현은 용해도 손실, 특히 등전점에서의 감소, 단백질 용액의 점도 증가, 자유 단백질 양의 증가로 감소합니다. 기능성 SH-rpypp 및 X선 산란 특성의 변화. 변성의 가장 특징적인 징후는 단백질의 생물학적 활성(촉매 항원 또는 호르몬)의 급격한 감소 또는 완전한 손실입니다. 변성 중에는 주로 비공유 결합(특히 수소) 결합과 이황화 결합이 파괴되고 단백질의 펩타이드 결합이 파괴됩니다. 폴리펩타이드 사슬의 백본 자체는 영향을 받지 않으며, 이 경우 천연 구형의 소구체가 단백질 분자를 펼치고 무작위적이고 무질서한 구조가 형성됩니다.

다루는 문제:
조직과 세포로부터 소기관과 막을 분리하는 방법.
세포하 분별의 단계: 추출,
균질화 및 원심분리, 그 특징.
세포하 구성요소의 분리 및 정제 방법.
막 입자의 분리.
막 분획의 식별, 정제 기준.
빛과 빛을 이용하여 불순물의 존재 여부를 모니터링합니다.
전자현미경, 지질 조성 분석 또는
마커 효소의 활성을 결정합니다.
분리된 막의 단백질 조성 결정
파벌. 마커 효소 활성 측정
특정 유형의 분리된 막 분획.

개별 세포 구성 요소를 얻으면 연구 가능
그들의 생화학 및 기능적 특성. 예를 들어 다음을 만들 수 있습니다.
단백질을 합성하는 리보솜의 무세포 시스템
실험자가 지정한 메신저 RNA에 따라. 선택된
선택된 조건 하에서 미토콘드리아는 ATP 합성을 수행할 수 있습니다.
적절한 효소의 참여로 분리된 염색질은
RNA 합성 등이 발생합니다.
최근에는 세포를 사용하지 않는 시스템을 사용하여 재현하고 있습니다.
세포 초분자 구조. 그래서 정제된 것을 사용하여
노른자 과립, 양서류 알 또는 해양 알의 세포질 추출물
고슴도치, 여기에 소개된 핵 봉투로 핵을 얻을 수 있습니다
무세포 외래 DNA 시스템(예: 박테리오파지 DNA).
이러한 DNA는 가스톤 단백질에 결합하는데, 이는 가스톤 단백질에 풍부하게 존재합니다.
이러한 추출물에서는 염색질(디옥시리보핵단백질)이 형성되고,
이중 멤브레인 쉘로 덮여 있으며 균일한 베어링을 갖추고 있습니다.
핵공. 이러한 모델 시스템은 미묘하고
예를 들어 거대분자를 세포질에서 세포질로 수송하는 친밀한 과정
핵심, 그 반대. 양서류 알의 세포질 추출물과
극피동물에서 이러한 핵은 유사분열에 의해 주기적으로 분열될 수 있습니다. 이것들
모델은 규제의 성격을 이해하는 데 큰 기여를 했습니다.
세포주기.

세포 소기관을 분리하려면,
시험 샘플을 분쇄하고
그런 다음 완충 배지에서 균질화됩니다.
Potter-Elvegem 균질화기를 사용하여
(유리 속에서 회전하는 테프론 막자
실린더). 이는 비교적 온화한 방법입니다.
불안정한 물질을 분리하는 데 특히 바람직함
분자와 미세구조. 기타 파괴 기술
세포에는 파괴하는 효소 용해가 포함되어 있습니다.
세포벽 또는 기계적 파괴
냉동 조직(갈거나 사용하여)
회전칼; 큰 압력을 받고 있습니다.
삼투성 충격; 다중 교대
냉동 및 해동).

손상되지 않은 세포 소기관을 분리하려면 환경이 중요합니다.
균질화가 수행되고, 등장성이었습니다. 즉,
완충액의 삼투압은 압력과 일치해야 합니다.
세포 내부. 용액이 저장성이라면 세포소기관은
추가 물을 "흡수"하고 터뜨립니다.
반대로 고장성 솔루션에서는 수축됩니다.
균질화 후 여과하여 제거합니다.
온전한 세포와 결합 조직. 실제로
세포 소기관의 분별은 다음을 사용하여 수행됩니다.
차등 원심분리, 즉 원심분리
다양한 로터 속도에서. 동시에 단계적으로
원심력의 증가 (보통 표현됨)
배수 정상 가속자유낙하 g
= 9.81 m/s2) 다양한 물질의 순차적 증착을 유도합니다.
세포 소기관, 즉 밀도에 따른 구분과
크기.

세포 구조를 분리하는 주요 방법 중 하나는 다음과 같습니다.
차등(분리) 원심분리. 그 원리
적용은 균질액 내 입자의 침전 시간이 입자에 따라 다르다는 것입니다.
크기와 밀도: 입자가 크거나 무거울수록 속도가 빨라집니다.
시험관 바닥에 가라앉을 것입니다. 정착 과정의 속도를 높이려면 다양한
원심분리기에 의해 생성된 가속도.
원심분리 중에는 낮은 가속도에서 핵이 먼저 안정됩니다.
파괴되지 않은 세포는 15-30,000g에서 큰 입자가 침전됩니다.
미토콘드리아, 작은 색소체, 과산화소체로 구성된 거대체,
리소좀 등, 50,000g의 마이크로솜, 액포 조각
세포 시스템.
이러한 혼합된 하위분획을 반복적으로 분획 원심분리할 때
순수한 분수를 얻을 수 있습니다. 따라서 거대체를 나눌 때
하위 분획은 미토콘드리아, 리소좀 및 과산화소체와 같이 별도로 얻습니다. ~에
마이크로솜을 분리함으로써 골지체 막의 일부를 얻을 수 있으며,
원형질막 조각, 액포, 과립 세망. 안에
더 미세한 분획 분리의 경우 원심분리가 사용됩니다.
성분의 우수한 분리를 가능하게 하는 자당 밀도 구배,
비중이 서로 약간 다릅니다.

세포 소기관의 분리는 일반적으로 낮은 수준에서 수행됩니다.
정도를 줄이기 위해 온도(0-5°C)
촉매반응으로 인한 물질의 분해
효소; 후자는 파기 과정에서 해제됩니다.
직물. 티올과 킬레이트제의 첨가가 필요합니다.
기능성 SH 그룹을 산화로부터 보호합니다.
분리된 분획을 생화학적 분석법으로 분석하기 전
방법을 사용하여 순도를 확인해야 합니다.
전자 현미경.
개별 세포 구성 요소를 얻으면 가능합니다.
생화학 및 기능적 특징을 연구합니다. 그래서 가능하다
리보솜을 위한 무세포 시스템을 생성합니다.
실험자가 지정한 대로 단백질을 합성합니다.
메신저 RNA. 선택된 분리된 미토콘드리아
분리된 염색질에서 ATP 합성을 수행할 수 있는 조건
적절한 효소의 참여로 발생할 수 있습니다
RNA 합성 등

원심분리법의 기본
용액의 입자가 침전(침전)되고,
밀도가 용액의 밀도보다 높을 때, 또는
밀도가 낮을 때 플로트(부양)
솔루션 밀도. 차이가 클수록
밀도가 높을수록 입자 분포가 더 빨리 발생합니다.
입자와 용액의 밀도가 같은 경우
(등밀도 조건), 입자가 남음
움직이지 않는. 밀도 차이가 작은 경우
입자는 원심분리기에서만 분리할 수 있으며,
여러 번 원심력을 발생시키는 것
중력을 초과합니다.

밀도와 침강계수의 관계
염화세슘(CsCl) 용액의 다양한 입자.

입자 침강 속도(ν)는 각도에 따라 달라집니다.
속도(Ω), 유효 로터 반경 ref(로부터의 거리)
회전축) 및 입자의 침강 특성.
입자의 침강 특성
침강 계수 S를 특징으로 하며
Svedberg 단위(1S = 10-13s)로 표현됩니다.
S의 값은 매우 다양할 수 있습니다. 을 위한
다양한 매체의 침강 계수 비교
일반적으로 물의 밀도와 점도에 따라 조정됩니다.
20oC (S20w).
침강 계수는 분자량에 따라 달라집니다.
(M) 입자, 그 형상(마찰계수 f),
부분 비체적 ΰ(값, 역수
입자 밀도).

밀도 구배 원심분리
크기나 밀도가 약간 다른 거대분자 또는 소기관
밀도구배 원심분리로 분리할 수 있다. 이러한 목적을 위해 두 가지
방법.
구역 원심분리에서는 분석할 시료(예: 단백질 또는 세포)
완충용액 위에 얇은 층으로 층을 이룬다. 원심분리 과정에서 입자가
밀도가 용액의 밀도보다 높기 때문에 용액을 통과하십시오. 이동 속도
입자의 질량과 모양에 따라 달라집니다(그림 A의 공식 참조). 원심분리가 중지되었습니다.
입자가 원심분리 튜브 바닥에 도달하기 전에. 그런 다음 바닥이 뚫려 있고
다양한 입자를 포함하는 여러 분획이 수집됩니다. 밀도 구배의 안정성
원심분리 과정은 탄수화물이나 콜로이드 용액을 사용하여 달성됩니다.
시험관 표면에서 바닥으로 갈수록 농도가 증가하는 실리카겔. 밀도 구배
분리 품질을 저하시키는 대류의 형성을 방지합니다.
등밀도 원심분리를 사용하면 샘플(예: DNA, RNA 또는 바이러스)이 균일하게
솔루션(일반적으로 CsCI)의 전체 볼륨에 분산됩니다. 이 경우 분할이 계속됩니다.
구역 원심분리보다 훨씬 더 오래 걸립니다. 밀도 구배는 다음에서 생성됩니다.
침전과 확산으로 인한 원심분리 과정. 시간이 지남에 따라 모든 입자는
자신의 부력 밀도에 해당하는 영역에 속합니다. 원심분리
평형이 확립되면 중지합니다. 생성된 분획은 다음을 사용하여 분석되었습니다.
적합한 측정 기술.

마커 분자
분별 과정에서 중요합니다.
분수의 순도를 제어합니다. 있음
이 또는 다른 세력의 특정 세력에서
세포 소기관 및 기타 구성 요소의 존재
마커 분자를 사용하여 결정됩니다.
이들은 일반적으로 세포 소기관에 따라 다릅니다.
효소 (마커 효소).
세포 내 마커 효소의 분포
현지화를 반영합니다.
상응하는 촉매 반응.

생체막의 기능과 구성
동물세포에서 가장 중요한 세포막
원형질막, 내부 및
핵외막, 막
소포체 및 골지체
, 내부 및 외부 미토콘드리아
막. 리소좀, 퍼옥시좀, 다양한
소포는 또한 막에 의해 세포질과 분리됩니다.
. 식물 세포에는 추가 막을 포함합니다
엽록체, 백혈구 및 액포. 모두
막은 극성입니다. 차이가 있다
관련하여 내부 및 외부 구성
세포질 층.

생체막과 그 구성요소는 다음 기능을 수행합니다.
1. 세포 및 소기관의 제한 및 분리. 세포 간 세포 분리
환경은 세포를 보호하는 원형질막에 의해 제공됩니다.
기계적 및 화학적 영향. 원형질막은 다음을 제공합니다.
또한 대사물과 무기 이온의 농도 차이를 유지합니다.
세포 내 및 외부 환경.
2. 대사산물과 이온의 통제된 이동은 내부 환경을 결정합니다.
항상성에 필수적입니다. 대사산물의 농도를 일정하게 유지하고
무기 이온 및 기타 생리학적 매개변수. 조정 가능하고
기공을 통한 대사물질과 무기이온의 선택적 수송
세포 분리로 인해 캐리어를 통한 전달이 가능해지며,
멤브레인 시스템을 사용하는 소기관.
3. 세포외 신호의 인식과 세포 내로의 전달 및 개시
신호.
4. 효소 촉매작용. 지질과 수성상 사이의 경계면에 있는 막 내
효소가 국소화되어 있습니다. 비극성 물질과의 반응이 일어나는 곳입니다.
기판. 예로는 지질 생합성과 비극성 대사 등이 있습니다.
생체이물질. 가장 중요한 에너지 반응은 막에 국한되어 있습니다.
산화적 인산화(호흡 사슬) 및 광합성과 같은 대사.
5. 세포간 기질과의 접촉 상호작용 및 타인과의 상호작용
세포 융합 및 조직 형성 중 세포.
6. 세포골격을 고정하여 세포와 소기관의 모양을 유지합니다.
그리고 세포 운동성.

시료를 균질화한 후 균질액을 원심분리합니다.
다음을 포함하는 별도의 분수
세포핵, 미토콘드리아 및 기타 세포 소기관뿐만 아니라
용해성 물질을 함유한 상등액
세포질의 단백질.
막 관련 단백질 추출 및 분해
올리고머 단백질을 프로토머로 변환
원하는 단백질이 어떤 구조와도 단단히 결합되어 있는 경우
세포라면 용액으로 옮겨야 합니다.
단백질 사이의 소수성 상호작용을 깨기 위해
막 지질, 세제가 용액에 추가됩니다. 더 자주
Triton X-100 또는 나트륨 도데실 황산염이 사용됩니다.
세제에 노출되면 일반적으로 소수성이 파괴됩니다.
올리고머 단백질의 프로토머 사이의 상호 작용

용액에서 비단백질 물질 제거
핵산, 지질 및 기타
비단백질 물질은 특수 물리화학적 방법을 사용하여 용액에서 제거할 수 있습니다.
속성. 그래서 지질은 쉽다.
삭제되었습니다
~에서
해결책
첨가
본질적인
용매,
예를 들어
아세톤. 그러나 영향은 다음과 같아야합니다.
단기. 아세톤 때문에
일부 단백질의 변성. 핵
용액에 첨가하면 산이 침전된다.
스트렙토마이신.

막 지질의 분리는 막을 얻은 후 즉시 수행됩니다.
단백질 및 지방분해 작용으로부터 보호되어야 하는 분획
효소, 자동산화.
일반적으로 모든 절차는 특정 온도를 유지하면서 낮은 온도에서 수행됩니다.
pH 및 이온 강도 값. 지질 추출을 위해 클로로포름-
메탄올 적혈구의 그림자로부터 단백질과 지질을 동시에 추출합니다.
부탄올-물 혼합물로 추출하였다. 이 경우 대부분의 단백질이 다음으로 옮겨집니다.
수성 및 지질을 부탄올 층으로 유입시킵니다.
인지질의 복잡한 혼합물의 정량 분석이 수행됩니다.
크로마토그래피 방법. 주로 약용으로 사용
컬럼 크로마토그래피. 미세 분석 연구에 성공
박층 크로마토그래피를 사용하여 분리합니다.
거의 모든 종류의 지질을 위치화하고 식별할 때
특수 시약을 사용합니다.
용출 능력에 따라 용매의 위치는 다음과 같습니다.
오름차순으로 석유 에테르, 시클로헥산, 사염화탄소,
톨루엔, 벤젠, 클로로포름, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 아세톤, n-프로판올,
에탄올, 메탄올, 물. 용매를 통과시킨 후 플레이트를 건조시킵니다.
특정 염색을 사용하여 공기를 주입하고 지질을 식별합니다.
시약. 분리된 인지질의 정량 측정용
분광광도법을 사용하는 박층 크로마토그래피.

멤브레인 연구는 크게
적어도 두 가지 주요 사항을 기반으로 합니다.
방법론적 기법: 이것이 바로 분해다
천연(즉, 천연) 막
구성 요소 및 후속
인공의 전체 또는 부분 조립
모두를 사용하는 막 또는
원래 멤브레인 구성 요소의 일부입니다.
멤브레인에 적용되는 이러한 기술은
"가용화"라고 불리는
"재건".

가용화를 위해서는 다음과 같은 세제를 사용하는 것이 좋습니다.
CMC가 낮습니다. 이러한 세제는 더 가볍기 때문입니다.
멤브레인에 내장되어 있어 속도가 더 빨라집니다.
혼합 미셀로 분해됩니다. 이 자격으로
이온 세제가 가장 효과적입니다.
능력을 특징짓는 매개변수로서
일반적으로 미셀화를 위한 세제
임계 농도를 사용하다
미셀 형성(MCM) 및 응집 수. KKM –
이는 세제가 녹기 시작하는 농도입니다.
미셀을 형성합니다. 그 전에는 물 속에 있어요.
실제 상태에서 단량체 형태로
해결책. 집계 숫자는 얼마나 많은지 나타냅니다.
미셀당 세제 분자.

가장 일반적으로 사용되는 네 가지 주요 제거 방법이 있습니다.
세제: 투석, 겔 여과, 고희석
소수성 폴리머에 대한 용해 및 세제 흡착.
더 빠른 길세제 제거를 기반으로
젤 여과, 가용화물이 불활성 용액을 통과할 때
기공 크기가 충분히 큰 젤
세제 분자, 그러나 형성된 분자에 비해 작음
사이를 자유롭게 통과하는 막 입자
젤 과립.
세제는 멤브레인에서 최대한 완벽하게 제거될 수 있습니다.
소수성 폴리머에 흡착하여 발생합니다. 이 방법
특히 잔여 세제 제거에 좋습니다.
이미 형성된 막 입자. 그러나 제거하려면
세제는 처음부터 가용화되므로 거의 쓸모가 없습니다.
재구성의 초기 단계에서 세제 제거는 다음과 같습니다.
상당한 양의 단백질과 지질이 흡착됨
폴리머에. 따라서 이 방법은 일반적으로 다음과 함께 사용됩니다.
다른 방법으로 세제 제거의 마지막 단계에서.

소금에 절이는 것: 알칼리염, 알칼리토금속(염화나트륨, 황산마그네슘), 황산암모늄으로 침전; 단백질의 1차 구조는 파괴되지 않습니다.

침적: 수분 제거 물질 사용: 저온(약 –20 С)에서 알코올 또는 아세톤.

이러한 방법을 사용하면 단백질이 수화 껍질을 잃고 용액에 침전됩니다.

변성- 단백질의 공간 구조 위반(분자의 기본 구조가 보존됨). 이는 가역적(변성제 제거 후 단백질 구조가 복원됨) 또는 비가역적(예를 들어 단백질이 농축된 무기산, 중금속 염으로 침전되는 경우 분자의 공간 구조가 복원되지 않음)일 수 있습니다.

단백질 분리 방법 저분자량 불순물로부터 단백질 분리

투석

특정 크기의 기공을 갖는 특수 고분자막이 사용됩니다. 작은 분자(저분자량 불순물)는 막의 구멍을 통과하고 큰 분자(단백질)는 유지됩니다. 따라서 단백질은 불순물로부터 씻겨 나옵니다.

분자량에 따른 단백질 분리

겔 크로마토그래피

크로마토그래피 컬럼은 특정 크기의 기공을 갖는 겔 과립(Sephadex)으로 채워져 있습니다. 단백질 혼합물이 컬럼에 추가됩니다. 크기가 Sephadex 기공 크기보다 작은 단백질은 기공에 "고착"되어 컬럼에 유지되고 나머지는 컬럼에서 자유롭게 빠져나옵니다(그림 2.1). 단백질의 크기는 분자량에 따라 다릅니다.

쌀. 2.1.겔 여과에 의한 단백질 분리

초원심분리

이 방법은 밀도 구배가 다른 용액(자당 완충액 또는 염화세슘)에서 단백질 분자의 다양한 침강(침강) 속도를 기반으로 합니다(그림 2.2).

쌀. 2.2.초원심분리에 의한 단백질 분리

전기영동

이 방법은 전하에 따라 전기장에서 단백질과 펩타이드의 이동 속도가 서로 다르다는 점을 기반으로 합니다.

젤, 셀룰로오스 아세테이트, 한천은 전기영동의 운반체 역할을 할 수 있습니다. 분리된 분자는 크기에 따라 젤 내에서 이동합니다. 더 큰 분자는 젤의 기공을 통과할 때 지연됩니다. 분자가 작을수록 저항이 적어서 더 빠르게 움직입니다. 결과적으로, 전기영동 후에는 더 큰 분자가 더 작은 분자보다 시작점에 더 가까울 것입니다(그림 2.3).

쌀. 2.3. 겔 전기영동에 의한 단백질 분리

전기영동을 사용하여 단백질을 분자량별로 분리할 수도 있습니다.이를 위해 그들은 사용합니다 나트륨 도데실 황산염(SDS-Na) 존재 하의 PAGE 전기영동.

개별 단백질의 분리

친화성 크로마토그래피

이 방법은 비공유 결합을 통해 다양한 분자에 강력하게 결합하는 단백질의 능력에 기초합니다. 효소, 면역글로불린, 수용체 단백질의 분리 및 정제에 사용됩니다.

특정 단백질이 특이적으로 결합하는 물질의 분자(리간드)는 불활성 물질의 입자와 공유 결합됩니다. 단백질 혼합물이 컬럼에 추가되고 원하는 단백질이 리간드에 단단히 부착됩니다. 나머지 단백질은 자유롭게 컬럼을 떠납니다. 그런 다음 잔류된 단백질은 유리 리간드가 포함된 완충액을 사용하여 컬럼에서 세척될 수 있습니다. 이 매우 민감한 방법을 사용하면 수백 가지 다른 단백질을 포함하는 세포 추출물에서 매우 적은 양의 단백질을 순수한 형태로 분리할 수 있습니다.

등전 포커싱

이 방법은 단백질의 다양한 IET 값을 기반으로 합니다. 단백질은 앰폴린(3~10 범위의 pH 구배가 미리 형성된 물질)이 있는 플레이트에서 전기 영동을 통해 분리됩니다. 전기영동 중에 단백질은 IET 값에 따라 분리됩니다(IET에서는 단백질의 전하가 0이 되며 전기장에서 움직이지 않습니다).

2D 전기영동

SDS-Na를 이용한 등전집속과 전기영동의 조합입니다. 전기영동은 먼저 암폴린이 담긴 플레이트에서 수평 방향으로 수행됩니다. 단백질은 전하(IET)에 따라 분리됩니다. 그런 다음 플레이트를 SDS-Na 용액으로 처리하고 수직 방향으로 전기 영동을 수행합니다. 단백질은 분자량에 따라 분리됩니다.

면역전기영동(웨스턴블롯)

샘플에서 특정 단백질을 식별하는 데 사용되는 분석 방법입니다(그림 2.4).

생물학적 물질로부터 단백질의 분리.

SDS-Na를 사용한 PAGE에서 전기영동을 통해 단백질을 분자량별로 분리합니다.

추가 작업을 용이하게 하기 위해 젤에서 폴리머 플레이트로 단백질을 옮깁니다.

비특이적 단백질 용액으로 플레이트를 처리하여 남은 기공을 채웁니다.

따라서 이 단계 후에는 분리된 단백질이 기공에 포함되어 있고 그 사이의 공간이 비특이적인 단백질로 채워져 있는 플레이트가 얻어집니다. 이제 우리는 어떤 질병을 일으키는 단백질이 우리가 찾고 있는 단백질 중에 있는지 확인해야 합니다. 검출을 위해 항체 처리가 사용됩니다. 1차 항체는 관심 단백질에 대한 항체입니다. 2차 항체는 1차 항체에 대한 항체를 의미합니다. 추가 특수 라벨(소위 분자 프로브)이 2차 항체에 추가되어 결과를 시각화할 수 있습니다. 2차 항체에 단단히 결합된 방사성 인산염이나 효소가 표지로 사용됩니다. 먼저 1차 항체에 결합한 다음 2차 항체에 결합하는 것은 방법의 표준화와 결과 개선이라는 두 가지 목적을 가지고 있습니다.

1차 항체 용액으로 처리  항원(원하는 단백질)이 위치한 플레이트 위치에서 결합이 발생합니다.

결합되지 않은 항체 제거(세척)

후속 개발을 위해 표지된 2차 항체 용액으로 치료합니다.

결합되지 않은 2차 항체 제거(세척)

쌀. 2.4. 면역전기영동(웨스턴블롯)

원하는 단백질이 생물학적 물질에 존재하는 경우, 이 단백질이 해당 항체에 결합되었음을 나타내는 밴드가 플레이트에 나타납니다.

단백질을 식별하기 위해 연구팀 내에서 개발된 EMBL 및 Sequest 데이터베이스에서 다양한 검색 시스템이 사용됩니다. 그러나 Mascot 검색 엔진은 단백질 식별의 표준이 되었습니다. 거의 모든 검색 엔진과 마찬가지로 웹 인터페이스를 사용하며 검색 엔진 자체는 인터넷에서 사용할 수 있지만 구매하여 사용자 컴퓨터에 설치할 수도 있습니다.

Mascot은 다양한 플러그형 단백질 및 게놈 데이터베이스와 함께 작동할 수 있습니다. 이는 NCBI 또는 SwissProt와 같은 광범위한 공개 데이터베이스이거나 상업용이거나 사용자가 직접 만든 데이터베이스일 수 있습니다.

모든 시스템에서 연구자가 얻은 질량 분석 데이터를 사용하여 알려진 단백질 구조와 비교하여 식별이 수행됩니다.

최근 수십 년 동안 단백질의 서열 분석이 본질적으로 이를 코딩하는 유전자의 서열 분석으로 축소되었다는 점을 고려하면 실제로는 실험적인 질량 분석 데이터를 알려진 게놈과 비교하여 단백질을 식별하는 것이 더 합리적입니다.

다양한 단백질 식별 알고리즘이 있지만 그 기능은 현재 알려진 게놈에 의해 제한됩니다. 하지만 유기체를 고려하면 다른 유형여전히 상동성 단백질을 갖고 있지만, 게놈을 알 수 없는 유기체로부터 단백질을 식별하는 것이 종종 가능합니다.

단백질체학 연구에 대한 다양한 방법론적 접근 방식은 근본적으로 다른 유형의 데이터를 제공하며 처리를 위해 고유한 계산 접근 방식이 필요합니다.

가장 접근하기 쉽고 성능이 뛰어난 방법은 질량 분석 펩타이드 맵을 사용하여 특정 단백질 분해 가수분해를 식별하는 것입니다. 영문학에서는 PMF(Peptide Mass Fingerprint)로 알려져 있으며, 트립신은 특정 프로테아제로 가장 자주 사용됩니다. 첫 번째 단계에서 분리된 단백질(예: 전기영동에 의해)은 단백질 분해 가수분해를 겪습니다. 이러한 가수분해의 결과로 펩타이드 혼합물이 얻어집니다. 매우 특이적인 프로테아제가 사용된다면 이는 매우 특이적인 펩타이드의 혼합물이 될 것입니다. 따라서 트립신을 사용하면 단백질이 아르기닌과 라이신으로 "절단"됩니다.

다음 단계는 생성된 혼합물의 질량 스펙트럼을 기록하는 것입니다. 결과는 분자량의 집합 또는 목록입니다. 이는 제품의 구조나 기타 특성에 대한 정보를 제공하지 않으며, 이 방법은 이것이 펩타이드의 분자량이고 이러한 펩타이드는 특정 가수분해의 결과로 형성되었다는 가정에만 기초합니다. 여기에 접근 방식의 주요 아이디어가 숨겨져 있습니다. 각 단백질에 자체 펩타이드 세트와 해당 분자 질량 목록이 있으면 역 문제를 해결하여 결과에 해당하는 단백질을 찾는 것이 가능합니다. 분자 질량 목록. 그리고 그러한 문제는 실제로 종종 해결될 수 있습니다.

특히 이를 통해 마스코트를 만들 수 있습니다.

GOST R 53761-2009

그룹 H19

러시아 연방의 국가 표준

우유

폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 방법을 통한 단백질 조성 확인

우유. 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 이용한 단백질 조성 확인

확인 67.100.10
옥스투 9209

도입일 2011-01-01

머리말

러시아 연방의 표준화 목표와 원칙은 2002년 12월 27일자 연방법 N 184-FZ "기술 규정"에 의해 확립되었으며, 러시아 연방의 국가 표준 적용 규칙은 GOST R 1.0-2004 "표준화"입니다. 러시아 연방. 기본 조항 "

표준정보

1 야로슬라블 지역 국가 기관 "야로슬라블 주립 원료 및 식품 품질 연구소"(GU YAO "YAGIKSPP")에서 개발

2 표준화 기술위원회 TC 470 "우유 및 우유 가공 제품"에 의해 도입됨

3 2009년 12월 15일 N 1271-st 연방 기술 규제 및 계측 기관 명령에 의해 승인 및 발효되었습니다.

4 처음으로 소개됨

이 표준의 변경 사항에 대한 정보는 매년 발행되는 정보 색인 "국가 표준"에 게시되며, 변경 및 개정 내용은 월간 발행 정보 색인 "국가 표준"에 게시됩니다. 본 표준이 개정(교체) 또는 취소되는 경우 해당 공지는 월간 발행 정보 색인 "국가 표준"에 게시됩니다. 관련 정보, 알림 및 텍스트는 공공 정보 시스템(인터넷상의 연방 기술 규제 및 계측 기관 공식 웹사이트)에도 게시됩니다.

1 사용 영역

이 표준은 다음에 적용됩니다. 가공되지 않은 우유폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 구성 성분에서 유제품 및 비유제품 유래 단백질을 식별하는 방법을 확립했습니다.

2 규범적 참고문헌

이 표준은 다음 표준에 대한 규범적 참조를 사용합니다.

GOST R 51652-2000 식품 원료의 정류 에틸 알코올. 명세서

GOST R 52054-2003 생우유. 명세서

GOST R 52349-2005 식품. 기능성식품. 용어 및 정의

GOST R 52738-2007 우유 및 우유 가공 제품. 용어 및 정의

GOST 12.1.004-91 산업 안전 표준 시스템. 화재 안전. 일반적인 요구 사항

GOST 12.1.005-88 산업 안전 표준 시스템. 작업 공간의 공기에 대한 일반적인 위생 및 위생 요구 사항

GOST 12.1.007-76 산업 안전 표준 시스템. 유해물질. 분류 및 일반 안전 요구사항

GOST 12.1.019-2009 산업 안전 표준 시스템. 전기 안전. 보호 유형의 일반 요구 사항 및 명명법

GOST 12.4.009-83 산업 안전 표준 시스템. 물체 보호를 위한 소방 장비. 주요 유형. 숙박 및 서비스

GOST 61-75 시약. 아세트산. 명세서

GOST 450-77 기술 염화칼슘. 명세서

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) 실험실 유리 제품. 실린더, 비커, 플라스크, 시험관. 일반적인 기술 조건

GOST 2603-79 시약. 아세톤. 명세서

GOST 3118-77 시약. 염산. 명세서

GOST 3769-78 시약. 황산암모늄. 명세서

GOST 5860-75 시약. 아미노산. 명세서

GOST 5867-96 우유 및 유제품. 지방 측정 방법

GOST 6259-75 시약. 글리세린. 명세서

GOST 6691-77 시약. 요소. 명세서

GOST 6709-72 증류수. 명세서

GOST 7730-89 셀룰로오스 필름. 명세서

GOST 12026-76 실험실 여과지. 명세서

GOST 13928-84 우유와 크림을 준비했습니다. 수용 규칙, 샘플링 방법 및 분석 준비

GOST 14919-83 가정용 전기 스토브, 전기 스토브 및 전기 프라이팬 캐비닛. 일반적인 기술 조건

GOST 16317-87 가정용 전기 냉동 기기. 일반적인 기술 조건

GOST 20478-75 시약. 과황산암모늄. 명세서

GOST 23932-90 실험실 유리 제품 및 장비. 일반적인 기술 조건

GOST 24104-2001 * 실험실 저울. 일반 기술 요구 사항
________________
* GOST R 53228-2008은 러시아 연방 영토에서 시행됩니다(이하 본문 참조). - 데이터베이스 제조업체의 메모.

GOST 25336-82 실험실 유리 제품 및 장비. 유형, 주요 매개변수 및 크기

GOST 26809-86 우유 및 유제품. 수용 규칙, 샘플링 방법 및 분석을 위한 샘플 준비

GOST 27752-88 전자 기계식 석영 테이블, 벽 및 알람 시계. 일반적인 기술 조건.

GOST 28498-90 액체 유리 온도계. 일반적인 기술 요구 사항. 테스트 방법

GOST 29227-91 실험실 유리 제품. 졸업식 피펫. 1부. 일반 요구사항

참고 - 이 표준을 사용할 때는 공공 정보 시스템(인터넷상의 연방 기술 규제 및 계측청 공식 웹사이트 또는 매년 발행되는 정보 색인 "National")에서 참조 표준의 유효성을 확인하는 것이 좋습니다. 표준'은 당해 연도 1월 1일자로 공표되었으며, 해당 연도에 공표된 해당 월간 정보 지수에 따른 것입니다. 참조 표준이 교체(변경)된 경우 이 표준을 사용할 때는 교체(변경) 표준을 따라야 합니다. 참조 표준이 대체 없이 취소되는 경우, 해당 참조 표준에 영향을 미치지 않는 부분에 참조 표준이 적용되는 조항이 적용됩니다.

3 용어 및 정의

이 표준은 규제 기관에서 정한 용어를 사용합니다. 법적 행위러시아 연방, GOST R 52349, GOST R 52738.

4 방법의 본질

전기영동은 외부 전기장의 영향으로 하전된 분자가 이동하는 현상을 기반으로 물질을 분리하는 방법입니다.

완충 용액(PAGE 겔)에 위치한 단백질 거대분자는 특정 총 전하를 가지며, 그 크기와 부호는 배지의 pH에 따라 달라집니다. 전류가 젤을 따라 흐르면 특정 전압 구배가 설정됩니다. 전기장이 형성됩니다. 이 장의 영향으로 단백질 거대분자는 전하량에 따라 음극이나 양극 쪽으로 이동합니다. 서로 다른 분자로 구성된 테스트 샘플은 동일한 분자량과 전하를 갖는 분자 구역으로 나뉘어 동일한 속도로 이동합니다. 시간이 지남에 따라 이러한 영역은 젤의 길이를 따라 줄무늬 형태로 분포되고 고정됩니다.

5 측정 장비, 보조 장비, 재료, 유리 제품 및 시약

다음 매개변수를 사용하는 수직 전기영동용 셀:

- 전체 셀 크기 260x190x300mm;

- 성형 폴리머로 제작된 중앙 온도 조절 저장소 및 튜브 어댑터

- 성형된 폴리카보네이트로 제작된 하부 전극 챔버 및 커버;

- 유리화 및 테플론 강화 폴리카보네이트로 제작된 클램프, 주입 스탠드 및 편심;

- 직경 0.254 mm의 백금 와이어로 만들어진 전극;

- 치수가 있는 유리판: 내부 - 200x200 mm 및 외부 - 200x225 mm;

- 전압 제한은 1000V입니다.

조정 가능한 전압 범위(20-5000)V, 전류(0.01-500)mA 및 전력(0.1-400)W를 갖춘 전압 소스.

다음 이상의 특성을 가진 컴퓨터: /Celeron 600/250 mb/HDD 4Gb/CD-ROM/비디오 카드 4 Mb.

최소 요구 사항이 있는 컬러 모니터: 화면 해상도 1024x768, 컬러 렌더링 품질 16비트.

최소 요구 사항이 있는 디지털 카메라: 해상도 1024x768, 매트릭스 - 130만 픽셀.

측정 범위(0-12) 단위를 갖춘 전위차 분석기. pH, 구분 값은 0.1 단위입니다. pH.

단일 계량 ±0.0003g의 절대 오차 한계를 가진 GOST 24104에 따른 1차 정확도 등급(특수)의 실험실 저울입니다.

GOST 28498에 따라 0°C ~ 100°C의 실험실 규모 온도계(구분 값 1°C).

와류형 진탕 장치(회전 속도 250-3000rpm).

Eppendorf 튜브용 "Gnome" 유형의 전자식 온도 조절 장치는 용량이 1.5cm이고 작동 온도 범위는 주변 온도에서 99°C까지입니다.

모든 유형의 가정용 전기 냉장고로 GOST 16317에 따라 냉장실 온도(4±2) °C를 유지합니다.

GOST 14919에 따라 모든 유형의 난방 조절이 가능한 가정용 전기 스토브.

지방 질량 분율이 0.05% 이하인 탈지유를 제공하는 가정용 전기 분리기입니다.

GOST 27752에 따른 2차 정확도 등급 시계입니다.

GOST 6709에 따른 증류수.

회전 속도가 최소 5000rpm인 실험실 원심분리기.

탁상형 미세원심분리기, Eppendorf 유형(회전 속도 13,000rpm 이상).

모든 유형의 전기 가열 조절이 가능한 자기 교반기.

50 °C의 온도로 가열되는 수조.

가변 용량의 단일 채널 피펫 디스펜서:

- 작업 볼륨 0.002-0.02 cm, 가변 볼륨 단계 0.001 cm;

- 작업 볼륨 0.02-0.2 cm, 가변 볼륨 단계 0.01 cm;

- 작업 볼륨 0.2-1cm, 가변 볼륨 단계 0.1cm.

GOST 12026에 따른 실험실 여과지.

GOST 7730에 따른 셀룰로오스 필름.

GOST 25336에 따른 깔때기 V-75-80 HS.

GOST 1770에 따른 실행 플라스크 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2.

실행 플라스크 1-100, Kn-1-50-14/23 XS, Kn-1-100-29/32 XS, Kn-1-250-24/29 XS, Kn-1-500-29/32 XS , GOST 25336에 따른 Kn-1-2000-29/32 HS.

GOST 1770에 따른 실행 실린더 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2.

GOST 23932에 따른 건조기.

GOST 29227에 따른 피펫 버전 1-1-2-10, 1-1-2-25.

GOST 25336에 따른 워터젯 펌프.

0.05cm 용량의 마이크로 주사기.

1.5cm 용량의 Eppendorf 미세원심분리 튜브.

GOST 25336에 따른 디자인 V-1-50 HS, V-1-100 HS, V-1-250 HS의 유리.

가변 용량 피펫 0.02, 0.2 및 1cm용 팁.

아크릴아미드(주성분의 질량분율이 99.9% 이상).

N",N"-메틸렌 비스아크릴아미드, 전기영동용.

트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄(주성분의 질량분율이 99.8% 이상).

GOST 6691에 따른 요소, 분석 등급.

쿠마시 브릴리언트 블루 G-250, 전기영동용.

GOST 5860에 따르면 화학적으로 순수한 아미노아세트산.

브로모페놀 블루, 전기영동용.

GOST 20478에 따르면 화학적으로 순수한 과황산암모늄.

N,N,N",N"-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 전기영동용.

GOST 2603에 따른 아세톤, 화학 등급.

GOST 6259에 따른 분석 등급의 글리세린.

에 따른 분석 등급의 디에틸 에테르.

GOST 3118에 따르면 화학적으로 순수한 염산.

GOST 3769에 따르면 화학적으로 순수한 황산암모늄.

GOST R 51652에 따른 에틸 알코올.

GOST 61에 따르면 화학적으로 순수한 빙하 아세트산.

GOST 450에 따른 무수 염화칼슘.

GOST 6709에 따른 증류수.

도량형 또는 기타 측정 장비, 보조 장치 및 시약을 사용할 수 있습니다. 기술적 인 특성표시된 것보다 나쁘지 않습니다.

6 분석용 샘플링

기본 개념과 일반 규칙샘플링 - GOST 13928 및 GOST 26809에 따름.

샘플은 2°C ~ 8°C의 온도에서 12시간 이내에 운송됩니다.

분석을 즉시 수행할 수 없는 경우 샘플을 (4±2) °C의 온도에서 24시간 이내에 냉장고에 보관하는 것이 좋습니다.

샘플 보존은 허용되지 않습니다.

7 분석 준비

7.1 용액 준비

7.1.1 몰 농도가 1 mol/dm인 염산 용액

1000 cm3 용량의 메스플라스크에 증류수 약 500 cm와 밀도 1.174 g/cm의 진한 염산 90 cm(또는 밀도 1.188 g/cm의 진한 염산 85 cm)를 넣고, 부드럽게 혼합하고 증류수로 결과량을 표시선까지 가져옵니다.

솔루션의 유효 기간은 3개월입니다.

7.1.2 몰 농도가 6 mol/dm인 요소 용액

50 cm 용량의 비이커에 요소(18.02 ± 0.01)g을 30 cm 증류수에 용해시키고, 50 cm 용량의 메스플라스크에 붓고 증류수를 사용하여 표시선에 맞춘다. .

7.1.3 납염료 용액

브로모페놀 블루(0.0040±0.0003)g을 1.5cm Eppendorf 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 1cm의 증류수를 추가한 후 Vortex shaker에서 혼합합니다(염료가 완전히 용해될 때까지).

(4±2) °C 온도에서 용액의 유효기간은 1개월입니다.

7.1.4 Tris-HCl 용액

100ml 용량의 비이커에 트리스-(하이드록시메틸)아미노메탄 (6.070 ± 0.001)g을 증류수 50ml에 녹이고 몰 농도가 1mol/dm인 염산 용액으로 (8.8)로 조정합니다. ± 0.1) 단위. pH를 100ml 용량 플라스크에 붓고 표시에 맞게 조정합니다.

7.1.5 폴리아크릴아미드 겔 단량체 용액

50 cm 용량의 원뿔형 플라스크에 아크릴아미드 (3.1040±0.0003) g, N",N"-메틸렌비스아크릴아미드 (0.0960±0.0003) g, 요소 (3.1040±0.0003) g, 트리스 8.75 cm를 첨가합니다. 7.1.4 및 26 cm의 증류수에 따라 제조된 HCl 용액. (50±5) °C의 온도에서 전기 가열을 사용하는 자석 교반기로 30분간 교반한 후 실온으로 냉각합니다.

(4±2) °C의 온도에서 마개가 접지된 유리플라스크에 담긴 용액의 유효기간은 1개월입니다.

참고 - 폴리아크릴아미드 겔용 용액의 양은 1회 분석 및 160x160x1mm 크기의 겔 획득을 위해 제공됩니다.

7.1.6 전극완충액

트리스-(히드록시메틸)아미노메탄 (4.50 ± 0.01) g과 아미노아세트산 (21.60 ± 0.01) g을 500 cm3 용량 플라스크에 넣고 300 cm3 증류수에 녹인 다음 표시선에 맞춰 부피를 맞춘 다음 용기에 붓습니다. 2000ml 용량의 삼각플라스크에 증류수 1000ml를 넣는다.

(4±2) °C의 온도에서 마개가 접지된 유리플라스크에 담긴 용액의 유효기간은 1개월입니다.

참고 - 하나의 분석에 대한 전극 버퍼의 양은 섹션 5에 지정된 매개변수를 사용하여 하나의 전기 영동 셀에 대해 제공됩니다. 다른 유형의 전기 영동 셀을 사용할 경우 전극 버퍼의 양은 이에 따라 조정되어야 합니다.

7.1.7 젤 염색 용액

500ml 용량의 삼각플라스크에 쿠마시브릴리언트블루(0.50±0.01)g을 넣고 에틸알코올 200ml, 빙초산 50ml 및 증류수 250ml를 넣는다. 플라스크의 내용물이 완전히 혼합됩니다.

(4±2) °C의 온도에서 마개가 접지된 유리플라스크에 담긴 용액의 유효기간은 1개월입니다.

7.2 대조 시료의 준비

대조 샘플을 준비하기 위해 GOST R 52054에 따라 방부제 및 억제 물질 없이 산도가 (16.0-20.0) °T인 원유를 사용합니다.

7.2.1 지방 분리

7.2.1.1 분리방법

분리 전 우유 (0.4-0.5)dm을 수조에서 (40-45) °C의 온도로 가열합니다.

분리기의 전기 구동을 켠 후 1~2분 후에 유관을 예열하기 위해 (40~50)°C의 온도로 가열된 증류수 1dm이 전기 분리기를 통과합니다. 다음으로 분리기의 전기 구동을 끄지 않고 예열된 우유를 부어 분리합니다. 분리 후 탈지유를 사용하여 추가 분석을 수행합니다.

7.2.1.2 원심분리 방법

(0.4-0.5) dm의 우유를 원심분리 튜브 또는 비커에 넣고 5000 rpm에서 (20-30)분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 원심분리용 튜브(유리잔)를 냉장고에 넣고 (4±2)℃의 온도로 냉각시킨다. 완전히 냉각되면 응고된 상단 지방층이 제거되고 남은 탈지유는 추가 분석에 사용됩니다.

7.2.2 단백질 분리

50 cm3의 미리 탈지유(GOST 5867-90에 따라 지방 질량 분율이 0.05% 이하)를 250 cm3 용량의 비이커에 넣고 수조에서 (35-35-90)의 온도로 가열합니다. 40) ℃에서 카세인을 침전시키고, 7.1.1에 따라 제조한 염산용액을 한 방울씩 첨가한다. 침전물을 가라앉히고 유청을 조심스럽게 따라냅니다. 침전물을 50 cm의 증류수를 첨가하여 세척하고, 교반하고, 침전시키고 물을 배출시킨다. 세탁은 최소 5회 이상 실시합니다.

세척한 침전물에 아세톤 30cm를 넣고 30분간 방치한 후 아세톤을 조심스럽게 따라냅니다. 지방이 완전히 제거될 때까지 이 작업을 반복하되 최소 5회 이상 수행합니다. 침전물을 접힌 건조 필터를 통해 여과하고 용량 250 cm의 원뿔형 플라스크로 옮기고 120 cm의 디에틸 에테르를 채우고 분쇄 마개로 닫습니다. 5분 이상 저어준 뒤 냉장고에 12시간 동안 넣어둡니다. 12시간 후, 침전물을 주름진 건조 필터를 통해 여과하고 흄후드에서 공기 중에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다.

(10.0±0.1)g의 건조된 시료를 100cm3 용량의 원추형 플라스크에 옮기고, 7.1.2에 따라 제조된 요소 용액 60cm3을 첨가하고, 온도(50±5)에서 자석 교반기에서 교반한다. ) 단백질이 완전히 용해될 때까지 ℃입니다. 생성된 용액을 셀로판 필름으로 만든 투석백에 옮기고 증류수에 담근 후 냉장고에 보관한다. 투석(저분자량 화합물에서 용액 제거)은 증류수를 주기적으로 교체하면서 최소 24시간 동안 수행됩니다. 그런 다음 생성된 침전물을 건조 접힌 필터를 통해 여과하고 데시케이터에서 무수 염화칼슘으로 최소 4시간 동안 건조합니다.

(4±2) °C의 온도에서 분리된 카세인의 유통기한은 2주를 넘지 않습니다.

카제인을 분리한 후 남은 유청을 용량 250 cm의 원추형 플라스크에 붓고 황산암모늄을 첨가하고(유장 25 cm 당(17.5 ± 0.1 g의 황산암모늄) 완전히 용해될 때까지 잘 혼합한다. (4±2)℃의 온도에서 냉장고에 12시간 보관하고, 분리된 단백질을 건조 접힌 필터로 여과한 후 셀로판필름으로 만든 투석백에 옮겨 증류수에 담근 후 투석용기에 넣는다. 냉장고. 투석은 증류수를 주기적으로 교체하면서 최소 24시간 동안 수행됩니다. 24시간 후, 생성된 침전물을 건조 접힌 필터를 통해 여과하고 데시케이터에서 무수 염화칼슘으로 4시간 이상 건조합니다.

(4±2)°C 온도에서 유청단백질의 유통기한은 2주를 넘지 않습니다.

7.3 시험 우유 샘플 준비

연구 중인 우유 샘플의 지방 분리와 단백질 분리는 7.2.1 및 7.2.2에 따라 수행됩니다.

7.4 단백질 용액 준비

7.4.1 단백질 대조 용액의 제조

7.2, 7.3에 따라 분리한 단백질(0.0040±0.0003)g을 Eppendorf 유형의 1.5cm 용량의 미세 원심분리 튜브에 넣고 7.1.2에 따라 제조한 요소 용액 0.5cm를 추가한 다음 온도 조절 장치에 보관합니다. 온도 95°C에서 5분 동안 단백질이 완전히 용해될 때까지 Vortex 진탕 장치를 사용하여 완전히 혼합합니다. 생성된 용액에 0.2 cm의 글리세롤과 7.1.3에 따라 제조된 0.025 cm의 주요 염료를 첨가하고 볼텍스 진탕 장치에서 완전히 혼합한 다음 3000 rpm의 빈도로 5분간 원심분리하고 생성된 침전물을 버립니다. 상층액은 분석에 사용됩니다.

(4±2) °C의 온도에서 단백질 용액의 유통기한은 7일을 넘지 않습니다.

7.4.2 시험 단백질 용액의 제조

연구 중인 단백질 용액의 제조는 7.4.1에 따라 수행됩니다.

8 분석조건

분석을 수행할 때 다음 조건이 충족되어야 합니다.


	주변 온도
	상대습도	30%에서 80%로
	대기압	84~106kPa
	주전원 전압
	교류주파수

9 분석 수행

겔 중합을 위해 챔버를 조립할 때 내부 - (200x200) mm 및 외부 - (200x225) mm 크기의 유리판이 사용됩니다.

1mm 두께의 스페이서(플레이트)가 긴 측면을 따라 오른쪽과 왼쪽의 외부 플레이트에 배치됩니다. 내부 유리판이 스페이서 위에 배치됩니다. 플레이트는 오른쪽과 왼쪽의 클램프로 고정되고 정렬용 홈이 있는 주입 스탠드에 배치됩니다. 증류수를 사용하여 챔버의 누출 여부를 확인한 후 제거합니다. 챔버의 누출 여부를 확인한 후 빗을 챔버의 플레이트 사이에 약간의 각도로 배치하여 구멍을 만듭니다.

겔 중합의 정상적인 과정을 보장하기 위해 7.1.5에 따라 제조된 단량체 용액을 워터젯 펌프에 연결된 튜브가 있는 플라스크에서 탈기합니다. 탈기 후, 과황산암모늄(0.0180±0.0003)g과 N,N,N,N"-테트라메틸에틸렌디아민 0.018cm를 용액에 첨가하고 용액에 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 혼합한다. 스페이서의 가장자리(빗의 올라간 면)를 따라 벌브가 있는 유리 피펫을 사용하여 용액을 중합 챔버에 도입합니다.

겔은 45분 동안 중합된 후 빗을 제거하고 겔에 형성된 웰을 증류수로 헹굽니다.

겔이 들어 있는 챔버를 온도 조절 부분에 부착하고 전기영동 셀에 배치합니다.

7.1.6에 따라 준비된 전극 완충액을 셀의 전극 챔버에 붓습니다.

7.4에 따라 제조된 대조 및 시험 단백질 용액을 마이크로주사기를 사용하여 전극 완충액 아래의 겔 웰에 첨가합니다. 대조 단백질 용액에는 젤의 가장 바깥쪽 웰을 사용하는 것이 좋습니다. 한 웰에 첨가되는 용액의 양은 (0.020-0.025) cm이며, 매 도포 후 마이크로시린지를 전극 완충액으로 철저히 세척합니다.

신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 테스트할 각 단백질 용액을 최소 3회 반복해서 추가하는 것이 좋습니다.

대조용액과 시험용액을 첨가한 후, 전기영동 셀을 뚜껑으로 닫습니다.

정전압 모드(120-130)V에서 (4-5)시간 동안 전기영동을 수행합니다.

참고 - 모드는 5에 지정된 매개변수가 있는 전기 영동 셀과 크기(160x160x1)mm의 폴리아크릴아미드 겔에 대해 표시됩니다. 다른 유형의 셀이나 크기가 다른 젤을 사용하는 경우 전기 영동 모드가 개별적으로 선택됩니다.

고르지 않은 열 분포와 단백질 영역(스트립)의 왜곡을 방지하려면 자동 온도 조절 탱크를 강제 냉각하는 것이 좋습니다.

선행 염료가 겔의 하단 가장자리에 도달하면 전기영동이 완료된 것으로 간주됩니다.

전기영동 후 겔을 전기영동 셀에서 조심스럽게 제거하고 고정하고 염색합니다. 7.1.7에 따라 제조된 용액에서 2시간 동안 고정과 착색을 동시에 수행하며, 공정 속도를 높이기 위해 (40±5) °의 전기 스토브에서 1시간 동안 젤을 염색하고 고정할 수 있습니다. C, 용액이 담긴 욕조 및 젤을 정기적으로 흔들어야 합니다.

착색된 젤은 배경이 완전히 제거될 때까지 10% 아세트산 용액에 끓여서 세척하며, 페인트가 씻겨 나가면서 세척 용액을 일정하게 변화시킵니다.

부록 A는 표준 분석 과정에서 벗어나는 원인을 제시하고 이를 제거하는 방법을 제안합니다.

전기영동 후 단백질 분리를 카메라를 이용해 시각화합니다. 생성된 전기영동도는 하드 자기 컴퓨터에 저장됩니다.

10 분석결과의 해석

유제품 및 비유제품 유래 단백질의 식별은 시각적으로 수행됩니다.

대조 용액과 시험 용액의 전기영동도(최소 3회 반복)에서 단백질 분획(밴드)이 일치하는 것은 제품에 유제품이 아닌 단백질이 없음을 나타냅니다(그림 1).

그림 1 - 비유제품 유래 단백질을 포함하지 않는 테스트 샘플의 단백질 용액의 전기영동도

테스트 샘플에 유제품이 아닌 단백질이 포함되어 있는 경우 전기영동도에는 대조 샘플에서 관찰되지 않는 추가 단백질 분획(밴드)이 포함됩니다(그림 2).

그림 2 - 비유제품 유래 단백질을 함유한 테스트 샘플의 단백질 용액의 전기영동도

테스트 샘플에 유제품이 아닌 단백질이 존재하는지 의심스러운 경우(개별 분획의 약한 이미지) 샘플의 단백질 농도를 높이고 분석을 반복하는 것이 좋습니다.

11 안전 요구사항

전기 영동 분석을 수행할 때 GOST 12.1.007에 따라 화학 시약을 사용할 때 안전 요구 사항, GOST 12.1.019에 따라 전기 설비를 사용할 때 전기 안전 요구 사항 및 다음에 명시된 요구 사항을 준수해야 합니다. 전기영동 셀에 대한 기술 문서 및 작동 지침.

방은 GOST 12.1.004에 따른 화재 안전 요구 사항을 충족해야 하며 GOST 12.4.009에 따른 소화 장비를 갖추고 있어야 합니다. 작업 영역 공기 중 유해 물질의 함량은 GOST 12.1.005에 따라 허용되는 값을 초과해서는 안됩니다.

신경독을 사용할 때는 특별한 주의를 기울여야 하며, 모든 조작은 고무 장갑을 끼고 흄후드에서만 수행해야 합니다.

고등 또는 중등 전문 생화학 교육을 받았거나 생화학 실험실에서 근무한 경험이 있고 훈련 과정에서 적절한 교육을 받고 방법을 숙지한 전문가가 분석을 수행하고 결과를 처리하는 것이 허용됩니다.

부록 A(참고용). 표준 분석 과정에서 벗어나는 이유와 이를 제거하는 방법

부록
(유익한)

표 A.1


편차	가능한 이유	구제책
1 젤 가장자리의 줄무늬가 중앙보다 높게 위치합니다.	젤의 중앙 부분이 가장자리보다 더 뜨거워집니다.	중앙 저장소에 냉각 용액을 채우십시오.
	과전압	(10-15) °C의 온도에서 냉각 용액을 펌핑합니다. 전압을 줄이다
2 선도염료의 확산	검체 단백질 용액 및/또는 완충 용액의 분해	새로운 시약으로 솔루션 준비
	확산	단백질 밴드가 주요 염료 밴드와 동일한 확산 특성을 갖는 경우 전류 강도를 (25-50)%만큼 증가시킵니다.
3 트랙의 수직 줄무늬	샘플 내 단백질의 과도한 농도	샘플의 단백질 농도를 줄입니다. 전압을 25% 줄인다
4개의 수평 트랙 줄무늬	단백질의 불완전한 용해	샘플을 완전히 용해시킵니다. 원심분리기
5 넓거나 흐릿한 줄무늬 또는 흰색 반점	느린 이동으로 인한 확산	전류 20% 증가
	이온 오염물질에 의한 화학적 변형	카르바마이드 용액 탈이온화
	불완전한 샘플 탈지	지방을 완전히 제거
6 줄무늬의 측면 흐림	전압이 켜지기 전에 우물 너머로 단백질 용액이 확산됩니다.	샘플 적용과 전압 적용 사이의 시간 단축
7 뒤틀린 줄무늬	우물 주변의 불충분한 겔 중합	겔 단량체 용액의 가스를 제거하고; 과황산암모늄과 N,N,N",N"-테트라메틸에틸렌디아민의 농도를 25% 증가시킵니다.
	샘플 내 염의 존재	투석으로 염분 제거
	고르지 못한 젤 표면	젤 준비를 위한 샘플링 단계를 확인하고 필요한 경우 시약을 교체하십시오.
8 전기영동은 5시간 이상 소요	고농도 전극 완충액	전극 완충액 준비 단계 확인(필요한 경우 완충액 희석), 증류수의 품질 확인, 시약 교체
	낮은 전압	전압을 (25-50)% 증가시킵니다.
9 전기영동이 너무 빠르고 분해능이 좋지 않음	버퍼가 너무 얇음	전극 완충액 준비 단계 확인, 증류수 품질 확인, 시약 교체
	전압이 너무 높음	전압을 (25-50)% 줄입니다.
10 대조 샘플의 밴드 간에 불일치가 있습니다.	단백질의 일부가 전기영동 중에 산화되었거나 시료 준비 단계에서 완전히 환원되지 않았을 수 있습니다.	새로운 대조 샘플을 준비합니다. 시약 교체

서지

2008년 6월 12일자 러시아 연방법 N 88-FZ "우유 및 유제품에 대한 기술 규정"

TU 2600-001-43852015-05 디에틸 에테르

전자문서텍스트

Kodeks JSC에서 준비하고 다음에 대해 검증했습니다.
공식 출판물
M.: 스탠다드인폼, 2010