Ферментативная активность бактерий. Ферментативная активность почв

Исследования по определению ферментативной активности МКД на основе различных бактерий проводились в четыре этапа. Для исследования были отобраны образцы МКД на основе монокультур МКД-В {Bifidobacter bifidum longum), МКД-S (Streptococcus termophilus ), МКД-P (Propionobacterium acidi-propionicum), МКД-L {Lactobacillus acidophilus).

Цель исследований - определение способности у пробиотических микроорганизмов, входящих в состав МКД, синтезировать ферменты.

На первом этапе по ГОСТ 20264.4-89 «Препараты ферментные. Метод определения амилолитической активности» во всех образцах МКД методом Айсона определялась суммарная амилолитическая активность. Метод Ансона основан на гидролизе крахмала ферментно-амилолитическим комплексом до декстринов различной молекулярной массы.

На втором этапе по ГОСТ 20264.2-88 «Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности» определялась суммарная протеолитическая активность (ПА) в исследуемых образцах. Метод основан на гидролизе белка казеината натрия ферментным комплексом при pH-7,2. Для определения ПА нейтральной протеазы 0-10 ед/мл проверены минимальные разведения. Кислая протеаза определялась при pH-5,5, при которой проходит гидролиз белка.

На третьем этапе по ТУ9291-008-13684916-05 во всех представленных образцах МКД определялась общая целлюлозолитическая активность (ЦА). Методика определения целлюлазы основана на определении восстанавливающих сахаров в результате гидролиза целлюлазы хроматографической бумаги под действием фермента. Метод рекомендован международной комиссией ИЮПАК по биотехнологии в качестве основного теста на целлюлазную активность. За единицу эффективности целлюлазы принимают такое количество фермента, которое при действии на хроматографическую бумагу при 50°С и pH 4,8 образует 1 ммоль восстанавливающих сахаров в 1 мин. Как правило, активность выражается в единицах на миллилитр.

Последним, четвертым, этапом было определение активности липазы (ЛА). Метод определения липазы по методике Скермана основан на титровании щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы, при использовании в качестве субстрата оливкового масла. При определении липазы использовалась реакционная смесь, состоящая из 6,5 мл 1/15 М фосфатно-цитрат- ного буфера, 2,5 мл эмульсии оливкового масла в 1 %-м растворе поливинилового спирта в соотношении 2:3 и 1 мл фильтрата культуральной жидкости.

Исследования МКД на основе различных микроорганизмов-пробиотиков показали, что все исследуемые МКД содержат одну или несколько групп ферментов (табл. 8). Так, МКД-В показала наличие всех исследуемых групп ферментов. МКД-Р содержит в своем составе три группы ферментов: амилолитические, протеолитические, целлюлозолитические. В МКД-L обнаружены также три группы ферментов: протеолитические, целлюлозолитические и липолитические, слабо выражена амилолитическая группа. МКД-S имеет в своем составе две группы ферментов: протеолитическую и целлюлозолитическую, амилолитическая и липолитическая активность выражены слабо.

Таблица 8

Ферментативная активность МКД, ед/мл

Анализируя данные, полученные в результате исследования ферментативной активности МКД, можно отметить, что все исследуемые МКД имеют высокую степень активности целлюлазы - от 64,46 (МКД-Р) до 72,4 ед/мл (МКД-L).

МКД-S и МКД-В имеют одинаковую активность целлюлазы - 66,7 ед/мл.

Все исследуемые нами МКД содержат кислую протеазу, в которой гидролиз белка осуществляется при pH-5,5. Наибольшая активность протеазы обнаружена в МКД-Р - 7,5 ед/мл, наименьшая - в МКД-L (1,0 ед/мл). МКД-В имеет значение активности протеазы 2,0, МКД-S - 2,5 ед/мл.

Активность липазы определена в МКД-L - 1,4 и в МКД-В - 12,6 ед/мл. В МКД-S и МКД-Р фермент липаза не обнаружен.

Амилолитическая активность обнаружена в МКД-В - 11,2 и в МКД-Р - 9,4 ед/мл.

На рис. 1^1 графически представлены значения ферментативной активности МКД.

Рис. 1.

Рис. 2.

Рис. 3.

Рис. 4.

Результаты исследования ферментативной активности МКД на основе различных бактерий согласуются с литературными данными о том, что бактерии-пробион- ты обладают ферментативной активностью. Наши исследования выявили лидирующие ферментные свойства бифидобактерий в составе МКД по сравнению с другими исследуемыми микроорганизмами. Различные штаммы бифидобактерий составляют, по некоторым данным, до 90 % представителей нормофлоры кишечника птицы. Бифидобактерии находятся во всех отделах кишечника.

Синтезируемые ими ферментные группы участвуют во всех ферментных процессах при превращению питательных веществ корма в желудочно-кишечном тракте. По мнению А. И. Хавкина (2003), бифидобактерии принимают активное участие в процессах энзиматического пререваривания кормов, усиливая гидролиз протеинов, сбраживают углеводы, омыляют жиры, растворяют клетчатку Все исследуемые нами бактерии в составе МКД показали определенную степень ферментативной активности. Полученные данные свидетельствуют о специфичности уровня и спектра производимых ферментных групп в зависимости от принадлежности микроорганизмов к определенным видам и условиям жизнедеятельности. Эти данные, в совокупности с остальными характеристиками, должны учитываться при разработке различных рекомендаций по применению тех или иных видов пробиотических кормовых добавок.

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и опреде­лить его варианты (так называемые биовары). Рассмот­рим основные ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окра­ску среды. Поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скопле­нию его в «поплавке» на жидких средах. «Поплавок» - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращен­ным вверх, которую до стерилизации помещают в пробир­ку со средой.

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбра­живая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщеп­ление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеп­лять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих жела­тин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен. Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока -оно приобретает вид молочной сыво­ротки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавлива­ют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 - 6 см. и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводо­рода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает пок­раснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Помимо указанных сред, способность микроорганиз­мов расщеплять различные питательные субстраты опре­деляют с помощью бумажных дисков, пропитанных опре­деленными реактивами (системы индикаторные бумажные «СИБ»). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37 °С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эрит­роциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

СОХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР

Выделенные и изученные культуры (штаммы), пред­ставляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля меди­цинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур - лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4 °С, лучше при -30-70 °С.

Восстановление высушенных культур.

Сильно нагрева­ют кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампу­лы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.

Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылить­ся находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры Можно также в жидком азоте (-196 °С) в специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следу­ющие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Меж­ду пересевами культуры хранят при 4 °С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столби­ком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганиз­мов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хра­нение при -20-70 °С; 4) хранение в запаянных пробир­ках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.

Глава 8. ФАГИ

Фаги - вирусы бактерий и ряда других микроорганиз­мов. В определенных условиях они вызывают лизис (растворение) своих хозяев. Действие фагов проявляется в природе и используется в практике.

Рис.42 Бактериофаги

История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Га­малея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов, В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исче­зали и что агент, лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность ра­створять свежие культуры микроорганизмов. Явление лизиса микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д"Эреллю.

Д"Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, кото­рые брал ежедневно у больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура выраста­ла. Но однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления больного.

Д"Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята большинством ученых.

Открытый вирус д"Эрелль назвал бактериофагом- пожирателем бактерий (от греч. фагос -пожирающий), а явление - бактериофагией.

С открытием электронного микроскопа была подтвер­ждена корпускулярная природа фага и изучена его морфо­логия.

Открытие д"Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и профилактики ряда инфекцион­ных болезней. В настоящее время фаги широко использу­ют в медицинской практике и при различных биологиче­ских исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.

СВОЙСТВА ФАГОВ

Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее изучены Т-фаги кишечной палочки). Их отросток представ­ляет собой полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной пластинкой с шипами и фиб­риллами. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком, без отростка и нитевидные

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой прохо­дит через последовательные стадии. Весь цикл занимает в разных системах фаг -бактерия от нескольких минут до 1-2 ч. Разберем последовательность этого процесса на примере Т-четного фага кишечной палочки.

Стадия I - адсорбция частиц фага на поверхно­стных рецепторах клетки осуществляется с помощью нитей хвостового отростка. На одной клетке могут адсор­бироваться сотни фагов (для лизиса клетки достаточно одного). Адсорбция фагов специфична.

Стадия II - проникновение (инъекция) нуклеино­вой кислоты фага в клетки у разных фагов происходит по-разному. У Т-фагов кишечной палочки шипы базальной пластинки соприкасаются с клеточной стенкой. Стержень «прокалывает» клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке, чаще всего лизоцим, разрушает цитоплазматическую мембрану. При этом чехол отростка сокращается, и через канал стержня нуклеиновая кислота фага «впры­скивается» в клетку. Пустая белковая оболочка фага («тень») остается снаружи.

Стадия III - репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки.

Стадия IV - сборка и формирование зрелых частиц фага.

Рис.43 Строение фага.

1 - головка; 2 - ДНК; 3 - стержень; 4 - чехол; 5 - базальная пластинка; 6-шипы; 7 - хвостовые фибриллы.

Рис.44 Морфология фагов.

1- фаги с головкой, отро­стком и сокращающимся чех­лом; 2--головка и отросток, без сократительной способно­сти; 3 - головка и короткий отросток; 4 -бесхвостые фа­ги; 5--нитевидные фаги.

Стадия V-лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Обычно происходит разрыв клеточной стенки и в окружающую среду выходит несколько сот новых фагов, способных поражать свежие клетки. Такой лизис называется лизисом изнутри.

В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке адсорбируется сразу очень боль­шое количество фагов. Они проделывают в клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытека­ет содержимое клетки. Таким образом, при лизисе извне фаг не размножается, и количество его частиц не увеличи­вается.

По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в окружающую среду большого количе­ства фаговых частиц, способных поражать новые клетки. При этом культура микроорганизмов лизируется. Жидкая среда становится прозрачной - происходит образование фаголизата - среды, в которой находится большое количество фагов. При развитии вирулентного фага в бактериях, растущих на плотной среде, образуются или прозрачные участки сплошного лизиса, или вырастают отдельные прозрачные образования - колонии фага. Их называют негативными колониями (бляшками). Колонии - разных фагов отличаются по величине и структуре.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популя­ции. С частью из них фаги вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в хромосому клетки и получает название про Фаг. Проис­ходит образование единой хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профаг, ставший частью генома клетки, при ее размножении может передаваться неограниченному числу потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) носит название л и з о г е н и я, а культура, в которой имеется про фаг, называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно поки­дать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превра­щаться в вирулентный фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают (лизируются), остальные сохраняют лизогенность.

Схема основных этапов взаимодействия фага с бактери­альной клеткой.

1 – внедрение нуклеиновой кислоты фага в клерку; 2-молодые, размножающиеся

фаги; 3 -зрелые фаги; 4 - выделение фагов.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно увеличиваются.

Умеренные фаги могут принести вред микробиологиче­скому производству. Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехо­да умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного штамма.

Умеренные фаги являются мощным фактором измен­чивости микроорганизмов. Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а клетка получит новые свойства.

Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах, выделени­ях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются хозяевами специфических для них фагов.

Устойчивость фагов к физическим и химическим факто­рам выше, чем у вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до.75°С, длительное высушива­ние, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиоти­кам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничто­жающих сопутствующую микрофлору. Поэтому эти веще­ства используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и дезинфицирующие вещества губительны для фагов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ

Применение фагов основано на их строгой специфично­сти и способности разрушать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.

Фагопрофилактика и фаготерапия-предупреждение и лечение инфекций с помощью фагов основаны на том, что, встречая в организме больного возбудителя болезни, фаг уничтожает его. В настоящее время фаги широко применяют при лечении и профилактике стафилококковых и стрептококковых поражений, даже таких, которые не поддаются действию антибиотиков, а также холеры, чумы и ряда других инфекций, например, инфекций, вызванных кишечной палочкой и протеем.

Фагодиагностика включает: а) идентификацию выде­ленных культур с помощью известных (диагностических) фагов. Культура соответствует тому фагу, который ее лизировал. Например, если лизис вызвал холерный фаг, то это культура холерного вибриона. Строгая специфич­ность типовых фагов дает возможность типировать вари­анты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд других вопросов; б) определение неизвестного фага по тест-культуре микробов. Если фаг лизирует культуру возбудителя дизентерии, то это дизентерийный фаг; в) ускоренный метод диагностики с помощью реак­ции нарастания титра фага РНТФ не требует выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон.

Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов биологии. С их помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей: при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.

ПРЕПАРАТЫ ФАГОВ

При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо изученными штаммами микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата.

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), в таблетках и свечах. Таблетка фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты желудочного сока.

Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и хранению фага.

Ферменты – это особый вид протеинов, которым природой отведена роль катализаторов разных химических процессов.

Этот термин постоянно на слуху, правда, далеко не все понимают, что такое фермент или энзим, какие функции выполняет это вещество, а также чем отличаются ферменты от энзимов и отличаются ли вообще. Все это сейчас и узнаем.

Без этих веществ ни люди, ни животные не смогли бы переваривать пищу. А впервые к применению ферментов в быту человечество прибегло более 5 тысяч лет тому назад, когда наши предки научились хранить молоко в «посуде» из желудков животных. В таких условиях под воздействием сычужного фермента молоко превращалось в сыр. И это только один из примеров работы энзима в качестве катализатора, ускоряющего биологические процессы. Сегодня ферменты незаменимы в промышленности, они важны для производства сахара, маргаринов, йогуртов, пива, кожи, текстиля, спирта и даже бетона. В моющих средствах и стиральных порошках также присутствуют эти полезные вещества – помогают выводить пятна при низких температурах.

История открытия

Энзим в переводе из греческого означает «закваска». А открытию этого вещества человечество обязано голландцу Яну Баптисту Ван-Гельмонту, жившему в XVI веке. В свое время он весьма заинтересовался спиртовым брожением и в ходе исследования нашел неизвестное вещество, ускоряющее этот процесс. Голландец назвал его fermentum, что в переводе означает «брожение». Затем, почти трема веками позже, француз Луи Пастер, также наблюдая за процессами брожения, пришел к выводу, что ферменты – не что иное, как вещества живой клетки. А через некоторое время немец Эдуард Бухнер добыл фермент из дрожжей и определил, что это вещество не является живим организмом. Он также дал ему свое название – «зимаза». Еще несколькими годами позже другой немец Вилли Кюне предложил все белковые катализаторы разделить на две группы: ферменты и энзимы. Причем вторым термином он предложил называть «закваску», действия которой распространяются вне живых организмов. И лишь 1897 год положил конец всем научным спорам: оба термины (энзим и фермент) решено использовать как абсолютные синонимы.

Структура: цепь из тысяч аминокислот

Все ферменты являются белками, но не все белки – ферменты. Как и другие протеины, энзимы состоят из . И что интересно, на создание каждого фермента уходит от ста до миллиона аминокислот, нанизанных, словно жемчуг на нить. Но эта нить не бывает ровной – обычно изогнута в сотни раз. Таким образом, создается трехмерная уникальная для каждого фермента структура. Меж тем, молекула энзима – сравнительно крупное образование, и лишь небольшая часть его структуры, так называемый активный центр, участвует в биохимических реакциях.

Каждая аминокислота соединена с другой определенным типом химической связи, а каждый фермент имеет свою уникальную последовательность аминокислот. Для создания большинства из них используются примерно 20 видов аминовеществ. Даже незначительные изменения последовательности аминокислот могут кардинально менять внешний вид и «таланты» фермента.

Биохимические свойства

Хотя при участии ферментов в природе происходит огромное количество реакций, но все они могут быть разгруппированы на 6 категорий. Соответственно, каждая из этих шести реакций протекает под влиянием определенного типа ферментов.

Реакции при участии энзимов:

1. Окисление и восстановление.

Ферменты, участвующие в этих реакциях, называются оксидоредуктазами. В качестве примера можно вспомнить как, алкогольдегидрогеназы преобразуют первичные спирты в альдегид.

1. Реакция переноса группы.

Ферменты, благодаря которым происходят эти реакции, называются трансферазами. Они обладают умением перемещать функциональные группы от одной молекулы к другой. Так происходит, например, когда аланинаминотрансферазы перемещают альфа-аминогруппы между аланином и аспартатом. Также трансферазы перемещают фосфатные группы между АТФ и другими соединениями, а с остатков глюкозы создают дисахариды.

1. Гидролиз.

Гидролазы, участвующие в реакции, умеют разрывать одинарные связи, добавляя элементы воды.

1. Создание или удаление двойной связи.

Этот вид реакций негидролитическим путем происходит при участии лиазы.

1. Изомеризация функциональных групп.

Во многих химических реакциях положение функциональной группы изменяется в пределах молекулы, но сама молекула состоит из того же количества и типов атомов, что были до начала реакции. Иными словами, субстрат и продукт реакции являются изомерами. Такого типа трансформации возможны под влиянием ферментов изомеразы.

1. Образование одинарной связи с устранением элемента воды.

Гидролазы разрушают связь, добавляя в молекулу элементы воды. Лиазы осуществляют обратную реакцию, удаляя водную часть из функциональных групп. Таким образом, создают простую связь.

Как работают в организме

Ферменты ускоряют практически все химические реакции, происходящие в клетках. Они имеют жизненноважное значение для человека, облегчают пищеварение и ускоряют метаболизм.

Некоторые из этих веществ помогают разрушать слишком большие молекулы на более мелкие «куски», которые организм сможет переварить. Другие наоборот связывают мелкие молекулы. Но ферменты, говоря научным языком, обладают высокой селективностью. Это значит, что каждое из этих веществ способно ускорять только определенную реакцию. Молекулы, с которыми «работают» ферменты, называются субстратами. Субстраты в свою очередь создают связь с частью фермента, именуемой активным центром.

Существуют два принципа, объясняющие специфику взаимодействия ферментов и субстратов. В так называемой модели «ключ-замок» активный центр фермента занимает в субстрате место строго определенной конфигурации. Согласно другой модели, оба участника реакции, активный центр и субстрат, меняют свои формы, чтобы соединиться.

По какому бы принципу ни происходило взаимодействие результат всегда одинаковый – реакция под воздействием энзима протекает во много раз быстрее. Вследствие такого взаимодействия «рождаются» новые молекулы, которые потом отделяются от фермента. А вещество-катализатор продолжает выполнять свою работу, но уже при участии других частиц.

Гипер- и гипоактивность

Бывают случаи, когда энзимы выполняют свои функции с неправильной интенсивностью. Чрезмерная активность вызывает чрезмерное формирование продукта реакции и дефицит субстрата. В результате – ухудшение самочувствия и серьезные болезни. Причиной гиперактивности энзима может быть как генетическое нарушение, так и избыток витаминов или , используемых в реакции.

Гипоактивность ферментов может даже стать причиной смерти, когда, например, энзимы не выводят из организма токсины либо возникает дефицит АТФ. Причиной такого состояния также могут быть мутированные гены или, наоборот, гиповитаминоз и дефицит других питательных веществ. Кроме того, пониженная температура тела аналогично замедляет функционирование энзимов.

Катализатор и не только

Сегодня можно часто услышать о пользе ферментов. Но что такое эти вещества, от которых зависит работоспособность нашего организма?

Энзимы – это биологические молекулы, жизненный цикл которых не определяется рамками от рождения и смерти. Они просто работают в организме до тех пор, пока не растворятся. Как правило, это происходит под воздействием других ферментов.

В процессе биохимической реакции они не становятся частью конечного продукта. Когда реакция завершена, фермент покидает субстрат. После этого вещество готово снова приступить к работе, но уже на другой молекуле. И так продолжается столько, сколько необходимо организму.

Уникальность ферментов в том, что каждый из них выполняет только одну, ему отведенную функцию. Биологическая реакция происходит только тогда, когда фермент находит правильный для него субстрат. Это взаимодействие можно сравнить с принципом работы ключа и замка – только правильно подобранные элементы смогут «сработаться». Еще одна особенность: они могут работать при низких температурах и умеренном рН, а в роли катализаторов являются более стабильными, чем любые другие химические вещества.

Ферменты в качестве катализаторов ускоряют процессы метаболизма и другие реакции.

Как правило, эти процессы состоят из определенных этапов, каждый из которых требует работы определенного энзима. Без этого цикл преобразования или ускорения не сможет завершиться.

Пожалуй, из всех функций ферментов наиболее известна – роль катализатора. Это значит, что энзимы комбинируют химические реагенты таким образом, чтоб снизить энергетические затраты, необходимые для более быстрого формирования продукта. Без этих веществ химические реакции протекали бы в сотни раз медленнее. Но на этом способности энзимов не исчерпываются. Все живые организмы содержат энергию, необходимую им для продолжения жизни. Аденозинтрифосфат, или АТФ, это своего рода заряженная батарейка, которая снабжает клетки энергией. Но функционирование АТФ невозможно без ферментов. И главный энзим, производящий АТФ, – синтаза. Для каждой молекулы глюкозы, которая трансформируется в энергию, синтаза производит около 32-34 молекул АТФ.

Помимо этого, энзимы (липаза, амилаза, протеаза) активно применяются в медицине. В частности, служат компонентом ферментативных препаратов, таких как «Фестал», «Мезим», «Панзинорм», «Панкреатин», применяемых для лечения несварения желудка. Но некоторые энзимы способны также влиять на кровеносную систему (растворяют тромбы), ускорять заживление гнойных ран. И даже в противораковой терапии также прибегают к помощи ферментов.

Факторы, определяющие активность энзимов

Поскольку энзим способен ускорять реакции во много раз, его активность определяется так называемым числом оборотов. Этот термин обозначает количество молекул субстрата (реагирующего вещества), которую способна трансформировать 1 молекула фермента за 1 минуту. Однако существует ряд факторов, определяющих скорость реакции:

1. Концентрация субстрата.

Увеличение концентрации субстрата ведет к ускорению реакции. Чем больше молекул действующего вещества, тем быстрее протекает реакция, поскольку задействовано больше активных центров. Однако ускорения возможно только до тех пор, пока не задействуются все молекулы фермента. После этого, даже повышение концентрации субстрата не приведет к ускорению реакции.

1. Температура.

Обычно повышение температуры ведет к ускорению реакций. Это правило работает для большинства ферментативных реакций, но только до тех пор, пока температура не поднимется выше 40 градусов по Цельсию. После этой отметки скорость реакции, наоборот, начинает резко снижаться. Если температура опустится ниже критической отметки, скорость ферментативных реакций повысится снова. Если температура продолжает расти, ковалентные связи рушатся, а каталическая активность фермента теряется навсегда.

1. Кислотность.

На скорость ферментативных реакций также влияет показатель рН. Для каждого фермента существует свой оптимальный уровень кислотности, при котором реакция проходит наиболее адекватно. Изменение уровня рН сказывается на активности фермента, а значит, и скорости реакции. Если изменения слишком велики, субстрат теряет способность связываться с активным ядром, а энзим больше не может катализировать реакцию. С восстановлением необходимого уровня рН, активность фермента также восстанавливается.

Ферменты, присутствующие в человеческом организме, можно разделить на 2 группы:

• метаболические;
• пищеварительные.

Метаболические «работают» над нейтрализацией токсических веществ, а также способствуют выработке энергии и белков. Ну и, конечно, ускоряют биохимические процессы в организме.

За что отвечают пищеварительные – понятно с названия. Но и здесь срабатывает принцип селективности: определенный тип ферментов влияет только на один вид пищи. Поэтому для улучшения пищеварения можно прибегнуть к маленькой хитрости. Если организм плохо переваривает что-то из еды, значит надо дополнить рацион продуктом, содержащим фермент, который способен расщепить трудно перевариваемую пищу.

Пищевые ферменты – катализаторы, которые расщепляют продукты питания до состояния, в котором организм способен поглощать из них полезные вещества. Пищеварительные энзимы бывают нескольких типов. В человеческом организме разные виды ферментов содержатся на разных участках пищеварительного тракта.

Ротовая полость

На этом этапе на пищу воздействует альфа-амилаза. Она расщепляет углеводы, крахмалы и глюкозу, которые содержатся в картофеле, фруктах, овощах и других продуктах питания.

Желудок

Здесь пепсин расщепляет белки до состояния пептидов, а желатиназа – желатин и коллаген, содержащиеся в мясе.

Поджелудочная железа

На этом этапе «работают»:

• трипсин – отвечает за расщепление белков;
• альфа-химотрипсин – помогает усвоению протеинов;
• эластазы – расщепляют некоторые виды белков;
• нуклеазы – помогают расщеплять нуклеиновые кислоты;
• стеапсин – способствует усвоению жирной пищи;
• амилаза – отвечает за усвоение крахмалов;
• липаза – расщепляет жиры (липиды), содержащиеся в молочных продуктах, орехах, маслах и мясе.

Тонкая кишка

Над пищевыми частицами «колдуют»:

• пептидазы – расщепляют пептидные соединения к уровню аминокислот;
• сахараза – помогает усваивать сложные сахара и крахмалы;
• мальтаза – расщепляет дисахариды к состоянию моносахаридов (солодовый сахар);
• лактаза – расщепляет лактозу (глюкозу, содержащуюся в молочных продуктах);
• липаза – способствует усвоению триглицеридов, жирных кислот;
• эрепсин – воздействует на протеины;
• изомальтаза – «работает» с мальтозой и изомальтозой.

Толстый кишечник

Здесь функции ферментов выполняют:

• кишечная палочка – отвечает за переваривание лактозы;
• лактобактерии – влияют на лактозу и некоторые другие углеводы.

Кроме названных энзимов, существуют еще:

• диастаза – переваривает растительный крахмал;
• инвертаза – расщепляет сахарозу (столовый сахар);
• глюкоамилаза – превращает крахмал в глюкозу;
• альфа-галактозидаза – способствует перевариванию бобов, семян, соевых продуктов, корневых овощей и листовых;
• бромелайн – фермент, полученный из , способствует расщеплению разных видов белков, эффективен при разных уровнях кислотности среды, обладает противовоспалительными свойствами;
• папаин – фермент, выделенный из сырой папайи, способствует расщеплению мелких и крупных протеинов, эффективен в широком диапазоне субстратов и кислотности.
• целлюлаза – расщепляет целлюлозу, растительные волокна (в человеческом организме не обнаружена);
• эндопротеаза – расщепляет пептидные связи;
• экстракт бычьей желчи – энзим животного происхождения, стимулирует моторику кишечника;
и других минералов;
• ксиланаза – расщепляет глюкозу из зерновых.

Катализаторы в продуктах

Ферменты имеют решающее значение для здоровья, поскольку помогают организму расщеплять пищевые компоненты до состояния, пригодного для использования питательных веществ. Кишечник и поджелудочная железа производят широкий спектр ферментов. Но кроме этого, многие их полезных веществ, способствующих пищеварению, содержатся также и в некоторых продуктах.

Ферментированные продукты являются практически идеальным источником полезных бактерий, необходимых для правильного пищеварения. И в то время, когда аптечные пробиотики «работают» только в верхнем отделе пищеварительной системы и часто не добираются до кишечника, эффект от ферментативных продуктов ощущается во всем желудочно-кишечном тракте.

Например, абрикосы содержат в себе смесь полезных энзимов, в том числе инвертазу, которая отвечает за расщепление глюкозы и способствует быстрому высвобождению энергии.

Натуральным источником липазы (способствует более быстрому перевариванию липидов) может послужить авокадо. В организме это вещество производит поджелудочная железа. Но дабы облегчить жизнь этому органу, можно побаловать себя, например, салатом с авокадо – вкусно и полезно.

Кроме того, что банан, пожалуй, самый известный источник калия, он также поставляет в организм амилазу и мальтазу. Амилаза содержится также в хлебе, картофеле, крупах. Мальтаза способствует расщеплению мальтозы, так называемого солодового сахара, который в обилии представлен в пиве и кукурузном сиропе.

Другой экзотический фрукт – ананас содержит в себе целый набор энзимов, в том числе и бромелайн. А он, согласно некоторым исследованиям, еще и обладает противораковыми и противовоспалительными свойствами.

Экстремофилы и промышленность

Экстремофилы – это вещества, способны сохранять жизнедеятельность в экстремальных условиях.

Живые организмы, а также ферменты, позволяющие им функционировать, были найдены в гейзерах, где температура близка к точке кипения, и глубоко во льдах, а также в условиях крайней солености (Долина Смерти в США). Кроме того, ученые находили энзимы, для которых уровень рН, как оказалось, также не принципиальное требование для эффективной работы. Исследователи с особым интересом изучают ферменты-экстремофилы, как вещества, которые могут быть широко использованы в промышленности. Хотя и сегодня энзимы уже нашли свое применение в индустрии как биологически и экологически чистые вещества. К применению энзимов прибегают в пищевой промышленности, косметологии, производстве бытовой химии.

Более того, «услуги» ферментов в таких случаях обходятся дешевле, чем синтетических аналогов. Кроме того, натуральные вещества являются биоразлагаемыми, что делает их использование безопасным для экологии. В природе существуют микроорганизмы, способные расщепить ферменты на отдельные аминокислоты, которые затем становятся компонентами новой биологической цепочки. Но это, как говорится, уже совсем другая история.

Понятие о ферментах

Ферментами (энзимами) называют растворимые или связанные с мембранами белки, наделенные каталитической активностью.(Кроме белков каталитическую активность в организме могут проявлять некоторые РНК (рибозимы) и антитела (абзимы), однако они в тысячи раз менее эффективны, чем ферменты.) Эти названия произошли от латинского «fermentatio» - брожение и греческого «en zym» - внутри закваски. Они напоминают о первых источниках ферментов. Биохимии, которая изучает ферменты, называется энзимология . На схемах и в уравнениях реакций молекулы ферментов обозначают - Е . Вещества, превращения которых катализируют ферменты, называют субстратами (S) . Продукты энзиматической реакцииобозначают - Р . Так как ферменты являются белками, их получают в гомогенном виде теми же способами, что и другие белки. Для ферментов характерны физико-химические свойства, присущие белкам.

Отличие ферментов от неорганических катализаторов:

а) ускоряют реакции значительно эффективнее;

б) наделены высокой специфичностью действия;

в) подвергаются регуляции в физиологических условиях;

г) действуют в мягких условиях.

Строение ферментов

Ферментами могут являться как простые, так и сложные (конъюгированные) белки, в состав которых могут входить липиды, углеводы, ионы металлов, азотистые основания, производные витаминов. В организме ферменты могут функционировать как в растворимом состоянии, так и в виде нерастворимых комплексов или входить в состав биологических мембран.

Отличительной особенностью ферментов является наличие активного центра . Активный центр - это уникальная комбинация сближенных в пространстве аминокислотных остатков, которая обеспечивает:

а) узнавание молекулы субстрата,

б) связывание субстрата с ферментом,

в) осуществление каталитического превращения (в случае сложного фермента в акте катализа также принимает участие кофермент, входящий в состав активного центра).

Активный центр возникает в тот момент, когда белок сворачивается и принимает свою нативную (активную) конформацию. Структура активного центра может изменятся при взаимодействии с субстратом. По образному выражению Д. Кошланда субстрат подходит к активному центру как рука к перчатке.

Одна молекула фермента, особенно если она состоит из нескольких субъединиц, может содержать более одного активного центра.

В активном центре имеются два участка. Первый участок отвечает за узнавание и связывание субстрата. Он называется субстрат-связывающим участком или якорной площадкой. Второй участок называется каталитическим, в его состав входят аминокислотные остатки, принимающие участие в акте катализа.

Ферменты представляют белки, сильно различающиеся по молекулярной массе и сложности строения. Примером фермента с небольшой молекулой является рибонуклеаза, состоящая из одной субъединицы с молекулярной массой 13700 Дa. (У рибонуклеазы определена аминокислотная последовательность. В 1969 г. рибонуклеаза была синтезирована в лаборатории Б.Меррифилда в Нью-Йорке.) Многие ферменты состоят из нескольких субъединиц, например, лактатдегидрогеназа состоит из четырех субъединиц двух видов. К настоящему времени известно несколько мультиферментных комплексов, состоящих из десятков различных субъединиц и нескольких типов коферментов. Например, пируватдегидрогеназный комплекс состоит из 60 субъединиц трех типов и пяти типов кофакторов. Молекулярная масса такого комплекса составляет 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Дa в зависимости от источника фермента. Молекула фермента может быть меньше, чем молекула субстрата. Например: молекулы ферментов амилазы и рибонуклеазы меньше, чем молекулы их субстратов – крахмала и РНК.

Белковая часть сложных ферментов каталитически неактивна и называется апоферментом . Связывание апофермента с небелковым компонентом приводит к образованию каталитически активного фермента (холофермента):

Многие ферменты содержат в своем составе ион металла, который может выполнять различные функции:

а) участвовать в связывании субстрата и процессе его каталитического превращения;

б) способствовать присоединению кофермента к молекуле фермента;

в) стабилизировать третичную структуру фермента (например Са 2+ в амилазе);

г) связываясь с субстратом, образовывать истинный субстрат, на который действует фермент.

Многие коферменты являются производными витаминов, поэтому нарушение обмена веществ при витаминной недостаточности обусловлено снижением активности определенных ферментов.

Некоторые ферменты наряду с активным центром содержат аллостерический (регуляторный) центр - участок белковой глобулы,вне активного центра, где могут связываться вещества, регулирующие ферментативную активность. Эти вещества называют аллостерическими эффекторами (аллостерическими активаторами или ингибиторами) . В результате связывания эффектора с аллостерическим центром происходит изменение структуры белка, приводящее к изменению пространственного расположения аминокислотных остатков в активном центре и, в итоге, к изменению ферментативной активности.

Ферменты, встречающиеся в одном организме и катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но с различной первичной структурой белка, называются изоферментами. Изоферменты отличаются друг от друга по таким физико-химическим свойствам, как молекулярная масса, термостабильность, субстратная специфичность, электрофоретическая подвижность. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты или их субъединицы. Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимую реакцию окисления лактата до пирувата, имеет четыре субъединицы двух типов М и Н, комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования пяти изоферментов ЛДГ (рис.1). Для диагностики заболеваний сердца и печени необходимо исследование изоферментного спектра ЛДГ в сыворотке крови, поскольку ЛДГ 1 и ЛДГ 2 активны в сердечной мышце и почках, а ЛДГ 4 и ЛДГ 5 - а скелетных мышцах и печени.

Рис.1 Строение различных изоферментов ЛДГ.

Измерение ферментативной активности

Определение активности ферментов осуществляется путем измерения скорости катализируемых реакций. Скорость ферментативных реакций измеряют по убыли концентрации субстрата или увеличению концентрации продукта за единицу времени:

v = -ΔС S /Δτ , v = ΔC P /Δτ ,

где ΔС S – изменение молярной концентрации субстрата (моль/л),

ΔC P - изменение молярной концентрации продукта реакции (моль/л),

Δτ - изменение времени (мин, сек).

Кинетические исследования желательно проводить при насыщающей концентрации субстрата, в противном случае фермент не будет иметь возможность проявить максимальную активность.

Единицы активности ферментов:

Международная единица фермента (U) - это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту при температуре 25 о С и оптимальном рН среды.

В системе СИ единицей фермента является катал (кат) –это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного мольсубстрата за 1 секунду. Нетрудно подсчитать, что:

1 U = (1 * 10 -6 М)/60 с = 1,67 * 10 -8 М с-1 = 1, 67 * 10 -8 кат = 16,7 нкат.

Часто определяют удельную активность препаратов фермента делением активности навески препарата фермента, выраженной в (U), на массу навески в миллиграммах:

А уд = U/масса препарата (мг)

При очистке ферментов удельная активность увеличивается. По возрастанию удельной активности можно судить об эффективности стадий очистки и чистоте ферментного препарата.

Для оценки активности высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов делением числа международных единиц (U) фермента в образце на количество вещества фермента (мкмоль) в этом образце рассчитывают молярную активность (число оборотов). По физическому смыслу молярная активность - это число молекул субстрата, подвергающихся превращению на одной молекуле фермента за 1 минуту или за 1секунду. Например: для уреазы, ускоряющей гидролиз мочевины, молярная активность составляет 30000, трипсина - 102, глюкозоксидазы - 17000 циклов в секунду.

Свойства ферментов

4.1. Механизм действия. Ферменты не смещают равновесие катализируемых реакций в сторону образования продуктов, таким образом, константа равновесия реакции остается постоянной. Как и все катализаторы, ферменты лишь уменьшают время достижения этого равновесия. В большинстве случаев ферменты ускоряют реакции в 10 7 - 10 14 раз. В основе эффективности ферментативного катализа лежит сильное снижение энергии активации реакции за счет превращения субстрата в продукт через переходные состояния.

4.2. Специфичность действия . Специфичность связывания с субстратом и пути протекания ферментативной реакции определяются апоферментом. Специфичность действия ферментов определяет направленный обмен веществ в организме.

О ферментах говорят, что они имеют узкую субстратную специфичность , если они действуют на очень небольшой круг субстратов. Иногда можно говорить об абсолютной субстратной специфичности, например, каталаза катализирует только одну реакцию - разложение пероксида водорода:

Для большинства ферментов характерна относительная (широкая, групповая) субстратная специфичность , когда они катализируют группу однотипных реакций. Например, алкогольдегидрогеназа катализирует превращения спиртов в альдегиды, причем в качестве субстратов могут выступать метанол, этанол, пропанол и другие спирты. Интересным является тот факт, что алкогольдегидрогеназа может окислять и нелинейные спирты, а также спиртовую группу, входящую в состав сложных молекул, в частности, этот фермент может катализировать превращение ретинола в ретиналь. Естественно, ферменты, наделенные широкой субстратной специфичностью, катализируют превращения субстратов с различной эффективностью.

Ферменты наделены также стереохимической специфичностью : их активный центр распознает молекулы субстратов по пространственной конфигурации. Например, оксидазы L-аминокислот активны только в отношении L-аминокислот и совершенно не действуют на их D-аналоги. Для окислительного дезаминирования D-аминокислот в живых организмах имеются оксидазы D-аминокислот, не действующие на L-аминокислоты. Именно способность активного центра связываться с определенными стереоизомерами субстрата лежит в основе функционирования таких ферментов, как рацемазы, которые превращают одни стереоизомеры в другие.

Специфичность путей превращения заключается в том, что один субстрат под действием разных ферментов может превращаться в продукты, различающиеся по структуре и роли в метаболизме.

Приведем пример: оксидазы L-аминокислот действуют на L-аминокислоты, превращая их в альфа-кетокислоты с образованием аммиака и пероксида водорода.

Декарбоксилазы L-аминокислот связываются с теми же субстратами, но катализируют другую реакцию: декарбоксилирование с образованием биогенных аминов и выделением углекислого газа.

Еще одним примером является возможность превращения глюкозо-6 фосфата под действием различных ферментов, по одному из возможных метаболических путей:

4.3. Термолабильность.

Как и многие белки, при повышении температуры ферменты подвергаются термической денатурации, что приводит к нарушению нативной конформации фермента и изменению структуры активного центра. Ферменты млекопитающих начинают заметно денатурировать при температурах выше 40 о С.

В связи с вышесказанным, ферментные препараты желательно хранить при пониженных температурах. Одним из лучших путей сохранения ферментов является их лиофилизация (высушивание при температуре ниже -70 о С в вакууме), переведение в частично денатурированное состояние с помощью солей аммония и помещение в холодильник.

4.4. Зависимость скорости реакции от температуры. Скорость ферментативных реакций, как и любых химических реакций, зависит от температуры. При повышении температуры на 10 о С скорость реакции увеличивается в 2-4 раза согласно правилу Вант-Гоффа. Однако при температурах выше 40 о С существенной становится денатурация ферментов, что приводит к уменьшению суммарной активности (рис. 2):

Рис. 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

4.5. Зависимость скорости реакции от рН. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН имеет колоколообразный вид (рис. 3). Значения рН, при которых наблюдается наиболее высокая скорость ферментативной реакции, называют оптимальными (рН-оптимум). Характер кривых и значение рН-оптимума зависит от природы заряженных групп субстрата и заряженных групп фермента (особенно тех, которые входят в активный центр). Оптимум рН для большинства ферментов лежит в пределах от 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН.

Однако, есть и исключения, например, пепсин наиболее активен при рН 1,5 – 2,0, а щелочная фосфатаза при рН 10,0 – 10,5 (рис. 4)

Рис. 4. Зависимости скорости ферментативной реакции (v) от рН среды.

При экстремальных (очень низких или очень высоких) значениях рН происходит нарушение третичной структуры молекулы фермента, приводящее к потере ферментативной активности.

Похожая информация.

Понятие активности фермента

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность - более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:

• масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата;
• время, потраченное на реакцию;
• количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие - это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей - бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества - моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени - минута, час, секунда,
• единицы массы или объема - грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные - катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т. д.

Например, известно,

2. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях - оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.